Тема: Специальные приемы микроскопии биологических объектов.

Цель: Физические основы, позволяющие получать изображение в оптическом микроскопе, его характеристики. Элементы электронной оптики,принцип работы электронного микроскопа, его возможности. Биофизика зрения. Диоптрическая система глаза. Освоить методику решения задач по данной тематике.

Задачи обучения:

· Усвоить физические основы, позволяющие получать изображение в оптическом и электронном микроскопах, их возможности. Понять биофизику зрения, рассмотреть глаз, как центрированную оптическую систему.

Основные вопросы темы:

• Оптическая система микроскопа, построение изображения объекта. (обсуждение на казахском языке)
• Формула увеличения оптического микроскопа.
• Максимальное (предельное) и полезное увеличение.
• Разрешающая способность микроскопа, предел разрешения.
• Электронный микроскоп, элементы электронной оптики.
• Глаз, как орган зрения. Диоптрическая система глаза.
• Законы преломления
• Волоконная оптика

Методы обучения - Обсуждение сообщений по данной теме, решение типовых и ситуационных задач

Информационно –дидактический блок.

Степень проникновения в микромир, изучение микромиразависит от возможности рассмотреть величину микрообъектов Современные оптические микроскопы позволяют получать большие увеличения с высокой разрешающей способностью. Однако оптическая микроскопия достигла предела своих возможностей из-за явлений, обусловленных волновой природой света (дифракции, интерференции).

Фундаментальное ограничение заключается в невозможности получить при помощи электромагнитного излучения изображение объекта, меньшего по размерам, чем длина волны этого излучения.

Оптическая система микроскопа состоит из системы короткофокусных линз: объектива и окуляра и дает увеличенное, мнимое и обратное изображение, наблюдаемое глазом в условиях нормальной аккомодации. Основной характеристикой микроскопа является увеличение, определяемое формулой: = . Увеличение микроскопа численно равно произведению линейного увеличения объектива и углового увеличения окуляра , . Применяя формулу линейного увеличения к объективу микроскопа, можно считать расстояние от предмета до объектива равным фокусному расстоянию объектива . Расстояние от объектива до изображения равняется сумме фокусного расстояния объектива и так называемой оптической длины тубуса или, пренебрегая фокусным расстоянием объектива, по сравнению с оптической длиной тубуса , имеют . Увеличения объектива и окуляра указываются на их оправе.

Можно предположить, что подбирая соответствующим образом значения величин получим микроскоп со сколь угодно большим увеличением. Однако на практике не используют микроскопы с увеличением свыше 1500-2000, так как возможность различения мелких деталей объекта в микроскопе ограничена. Это ограничение обуславливается влиянием дифракции света, происходящей в структуре рассматриваемого объекта. В связи с этим вводят понятие разрешения и разрешающей способности микроскопа. Нормальный глаз на расстоянии наилучшего зрения различает мелкую структуру, состоящую из линий и точек, при условии, что они находятся на расстоянии не менее 0.07 мм. Качество микроскопа определяется не только увеличением, но и разрешением. Пределом разрешения называют наименьшее расстояние между двумя точками объекта, когда эти точки различимы, т.е. воспринимаются в микроскопе не сливающимися друг с другом. Разрешающей способностью называется способность микроскопа давать раздельное изображение мелких деталей объекта. Оптический микроскоп дает возможность различать структуры до 0.25 мк. Разрешающая способность есть величина обратная пределу разрешения.

Из теоретического курса известно, что предел разрешения микроскопа определяется по формуле , где длина волны света, освещающего объект, n показатель преломления среды между объективом и предметом, U aпертурный угол объектива, равный половине угла между крайними лучами конического светового пучка, входящего в объектив микроскопа. При освещении объекта белым светом длину волны считают равной 0.555 мк, таккак глаз к ней наиболее чувствителен. Таким образом полезное увеличение микроскопа обычно находится в интервале 500 А < G < 1000 А. Дальнейшим усовершенствованием микроскопа явилось применение иммерсионного объектива. Так называют объектив, у которого пространство между наблюдаемым предметом и объективом заполнено прозрачной жидкостью, с показателем преломления близким к стеклу n(1.45-1.65). при иммерсионном объективе во первых значительно увеличивается яркость изображения (что объясняется тем, что при иммерсии свет от предмета до объектива проходит по оптически однородной среде и не дает потерь на отражение) величина A=nsinU для иммерсионного объектива называется численной апертурой и для сухого объектива (A=sinU), обозначается на его оправе вместе с увеличением. Максимальный апертурный угол может быть порядка 70, тогда для сухого объектива численная апертура А=sin 70=0.94, для иммерсионного при n=1.5 А=1.5*0.94=1.4

При освещении предмета белым светом можно считать мк (длина волны, к которой глаз наиболее чувствителен), тогда предел разрешения для сухого микроскопа =0.5, для иммерсионного.

Объектива мк. Для того, чтобы эти объекты были различимы также и глазом увеличение микроскопа должно быть не меньше величины, определяемой соотношением пределов разрешения глаза и микроскопа

Такое увеличение называют полезным увеличением микроскопа. Практически увеличение микроскопа берут равным , где А – численная апертура.

Электронный микроскоп

Проникнуть глубже в микромир возможно в электронной микроскопии.

Электронная микроскопия - исследование с помощью ЭМ микроструктур тел вплоть до атомно- молекулярного уровня их локального состава. ЭМ даёт возможность получать сильные увеличения объектов,позволяет увидеть такие мелкие объекты, которые не разрешимы в оптическом микроскопе.

Применение ЭМ в биологии и медицине позволило изучить сверхтонкую структуру клетки внеклеточных компонентов тканей. На основании результатов,полученных с помощью ЭМ(максимальное разрешение которых для биологических объектов 12-6 А, а увеличение до 800—1200тыс.), начиная с 1940 годов было описано тонкое строение мембран, митохондрий. рибосом и других клеточных, а также внеклеточных структур, выявлены некоторые макромолекулы, например ДНК.

С изобретением электронного микроскопа 1950-е годы –начало создания современной науки об исследовании и изучении микромира.

ЭМ---Электрон, обладающий свойствами не только частицы, но и волны может быть использован как опорное электронное излучение в микроскопии. Длина волны электронного излучения зависит от его энергии, а энергия электрона Е=e*U

где U- разность потенциалов,проходимая электроном, e -заряд электрона. Длина волны электронного излучения при прохождении разности потенциалов 200000 вольт составляет порядка 0,1 нм. Электронное излучение легко сфокусировать электромагнитными линзами,электронное изображение может быть легко переведено в видимое. Современные ЭМ обеспечивают субатомное разрешение

В основе работы эл. микроскопа лежит свойство электрических и магнитных полей оказывать на электронные пучки фокусирующее действие. Таким образом, роль линз в электронном микроскопе играет совокупность, соответствующим образом рассчитанных, Эл. и магнитных полей; устройства,создающие эти поля называют «электронными линзами».

Существует 3 основных видов ЭМ: обычный просвечивающий ЭМ, растровый (сканирующий) ЭМ (1950-годы), растровый туннельный микроскоп (1980-е годы).

ОПЭМ –во многом схож с оптическим, Отличие в том, что для освещения используется не свет. а поток электронов. В состав ОПЭМ входят: электронный прожектор, ряд конденсорных линз, объективная линза и проекционная система, которая соответствует окуляру, но проецирует действительное изображение на фотопластинку??Электроны ускоряются сильным Эл. полем (порядка 100000 вольт), поле фокусирует электроны в узкий пучок. В колонке микроскопа, где движутся электроны, должен быть обеспечен вакуум ЭМ состоит из нескольких компонентов:

- вакуумная система

- источник электронов (электронный прожектор)создающий потоки электронов

- источник высокого напряжения для ускорения электронов

- система электромагнитных линз и элстат. пластин для управления электронным лучом

- экран на который проецируется увеличенное электронное изображение

Используя современные ОПЭМ получают увеличение от 1000 до 1000000.

Изобретение в1982г. Г. Бинингом и Рокером сканирующего туннельного микроскопа, который не накладывает ограничений на размеры образцов, реально открыло двери в новый микроскопический мир (Нобелевская премия по физике 1986 г.)

В настоящее время электронно–микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры передаётся прямо в компьютер, используя принтер можно получить отпечатки полученных изображений.