Пит среды, состав, значение

Китта- Тароцци мясопептонный бульон глюкоза, кусочки печени, вазелиновое предназначено для культивирования анаэробов для чего какой компонент добавляют

ПЦР

1. ОПРЕДЕЛИТЬ МОРФОЛОГИЮ МИКРООРГАНИЗМОВ (ПО ГОТ. МАЗКАМ).

1. Микроскопия мазков в световом микроскопе с иммерсионной системой (оптическая система, в которой пространство между 1 линзой и предметом заполнено жидкостью. d=0,61h/A, где d – предел расширения, h – длина волны и А – апертура Для достижения лучшего разрешения, контраста).

2. На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла.

3. Помещают препарат на столик микроскопа и под контролем зрения опускают иммерсионный объектив в масло.

4. Макровинтом находят поле зрения

5. Микровинтом устанавливают четкость изображения.

6. Изучают форму (кокки, палочки, спирохеты), размеры, расположение микроорганизмов. В зависимости от способа окраски выявляют дополнительные структуры (капсулу, споры, зерна волютина и т.д.).

2. ОПРЕДЕЛИТЬ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ (ПО ГОТОВЫМ МАЗКАМ).

1. Взять предметное стекло с готовым микропрепаратом, окрашенным по Граму.

2.Нанести на препарат каплю иммерсионного масла.

3.Провести микроскопию в световом микроскопе с увеличением объектива 90.

4. Определить форму микробных клеток и отношение к окраске по Граму.

3. ПРИГОТОВИТЬ МАЗОК ИЗ АГАРОВОЙ КУЛЬТУРЫ, ОКРАСИТЬ ПО ГРАМУ. ОПРЕДЕЛИТЬ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА.

1. Стекло обезжиривают мылом. (Цель - тонкий, равномерный мазок. Улучшает адгезию)

2. Ограничивают стеклографом место для нанесения мазка с обратной стороны от обезжиривания.

3. Стерильной бактериологической петлей на стекло наносят каплю физиологического раствора.

4. Пробирку с агаровой культурой бактерий берут в левую руку, а петлю за петледержатель – в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее IV и V пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку со скошенным агаром, охлаждая петлю о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и закрывают пробкой.

Петлей с культурой прикасаются к капле физиологического раствора до появления легкого помутнения. Избыток культуры сжигают в пламени спиртовки, после чего петлю охлаждают прикосновением к стеклу и равномерно распределяют каплю по стеклу в виде круга. Мазок высушивают, фиксируют трехкратным проведением препарата через пламя горелки.

Окрашивают мазок по Граму:

1. Наносят на фильтровальную бумагу, пропитанную карболово–спиртовым раствором генцианового фиолетового, дистиллированную воду на 1–2 минуты (для входа красителя), снимают фильтрованную бумагу

2. Наносят раствор Люголя почернение, образуется комплекс генциан-фиолетовы – йод. На этом этапе все бактерии фиолетовые) на 1–2 минуты, сливают его.

3. Наливают пипеткой этиловый спирт на 30 секунд.(Происходит дифференциация на Гр+ и Гр-. У Гр+ стенка толстая, происходит набухание пептидогликана, поры закрыты. У Гр- стенка тонкая, поры открыты, спирт вымывает генцианфиолетовый) Тщательно промывают водой.

4. Докрашивают водным раствором фуксина 1–2 минуты.(Гр- окрашиваются в красный) Промывают и высушивают мазок. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

4. ПРОИЗВЕСТИ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГНОЯ И ОПРЕДЕЛИТЬ МОРФОЛОГИЮ И ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИМЕЮЩИХСЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.

Взять чистое предметное стекло, произвести обезжиривание его натиранием кусочком сухого мыла, мыло со стекла тщательно удалить с помощью ваты. Место мазка на стекле обозначить карандашом-стеклографом в виде овала в центре стекла площадью примерно 1/3 предметного стекла. Овал начертить на стороне, обратной обезжиренной.

Взять в правую руку бактериальную петлю, простерилизовать в пламени горелки. В левую руку взять пробирку с гноем. Мизинцем правой руки плотно захватить наружный конец ватной пробки, прижав ее к ладонной поверхности руки, и вынуть пробку из пробирки. Обжечь край пробирки в пламени спиртовки. Опустить петлю в пробирку, остудив о стенку, взять материал. Вынуть петлю из пробирки. Быстро обжечь край пробирки и внутреннюю часть пробки. Пробирку закрыть пробкой, поставить в штатив.На предметное стекло в центр овала внести каплю гноя и равномерно круговыми движениями распределить по всей площади овала. После этого петлю тотчас же, не выпуская из рук, простерилизовать в пламени горелки. Мазок высушить при комнатной температуре на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.

Сухой мазок зафиксировать нагреванием на пламени горелки. Стекло держать за край мазком вверх и 3 раза провести через среднюю часть пламени.

Зафиксированный мазок окрасить по Граму (см. это в вопросе №3).

На окрашенный препарат нанести каплю иммерсионного масла. Провести микроскопию в световом микроскопе с увеличением объектива 90.

Определить форму микробных клеток и отношение к окраске по Граму.

5. СДЕЛАТЬ ПОСЕВ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА ПЕТЛЕЙ НА ЖИДКУЮ И ПЛОТНУЮ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. ВИДЕО 7

Пробирку с исследуемым материалом берут в левую руку, а петлю за петледержатель – в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и закрывают пробкой. Далее в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Открывают пробирку с жидкой средой и вносят материал петлей в верхнюю часть жидкой среды. Пробирку закрывают как описано выше.

6. ВЫПОЛНИТЬ 1 ЭТАП ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ, ОЦЕНИТЬ КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПО ГОТОВЫМ ПОСЕВАМ. ВИДЕО 5

Цель выделения чистой культуры – изучение всех свойств и определение вида микроорганизма, определение морфологических, тинкториальных, биохимических и антигенных свойств).

Бактериологическую петлю стерилизуют в пламени спиртовки (до ее покраснения). Над пламенем спиртовки открывают пробирку с исследуемым материалом. Мизинцем и ладонной поверхностью правой кисти зажимают пробку и вынимают ее. Обжигают края пробирки и пробку, петлю держат как писчее перо. Погружают петлю в исследуемый материал после ее охлаждения в пробирке. Извлекают петлю материала, закрывают пробку над пламенем спиртовки и ставят ее в штатив. Слегка открывают чашку Петри (Цель – получить изолированные колонии. Особенности посева: 1. Петля должна скользить, 2. Кладется плашмя, 3. От узкой части к середине) Для разобщения микробных клеток материал распределяют петлей параллельными штрихами на обе половины чашки. Закрытую чашку, дном кверху, помещают в термостат на 24 часа. Оценку культуральных свойств проводят с учетом величины, пигмента, формы, края колонии и консистенции колонии.

7. Произвести посев на косой агар с целью выделения чистой культуры микроорганизмов.

Берут чашку Петри с МПА с ростом колоний. Отмечают на дне чашки изолированную колонию. Стерилизуют бактериальную петлю в пламени спиртовки. Левой рукой открывают чашку Петри, на бортике чашки охлаждают бактериальную петлю. Петлей снимают часть отмеченной колонии, чашку Петри закрывают.

Берут в левую руку пробирку со скошенным агаром и мизинцем правой руки плотно захватывают наружный конец ватной пробки, прижав ее к ладонной поверхности руки, и вынимают пробку из пробирки. Обжигают край пробирки в пламени горелки. Опускают петлю с взятой колонией бактерий до конденсационной воды у дна пробирки и проводят зигзагообразную линию, скользя петлей по поверхности агара от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи от конденсационной воды до верхней части косого агара. Вынимают петлю из пробирки. Быстро обжигают край пробирки и внутреннюю часть пробки. Пробирку закрывают пробкой. Прокаливают петлю в пламени и ставят ее в штатив. Засеянную пробирку подписывают, ставят в штатив, который помещают в термостат.

8. Сделать посев исследуемого материала на чашку с МПА сплошным газоном.

Один мл исследуемого материала набирают стерильной пипеткой и выливают в чашку Петри (слегка открыв ее). Легким покачиванием чашки распределяют материал по всей поверхности агара.

9. Учесть биохимические свойства выделенной культуры.

В настоящее время для определения биохимических свойств используются тест-системы с набором различных субстратов (15-20 и более). Биохимические ингредиенты с индикаторами в лунках полимерного планшета находятся в высушенном виде. В лунки добавляют взвесь микроорганизмов в жидкой питательной среде. При культивировании микробов происходит расщепление субстратов с изменением цвета индикатора. Фирмы-изготовители выпускают тест-системы с разнообразными таблицами признаков и устройствами на основе компьютера для автоматизированного учета результатов.

10. Выполнить 1 этап бактериологического исследования испражнений больного при подозрении на дизентерию.

Произвести посев испражнений петлей в чашку Петри с питательной средой Плоскирева (технику посева и состав среды см. в вопросах №6 и 24).

Используется для выращивания шигелл. Состав: МПА, лактоза, соли желчных кислот и бриллиантовая зелень (для угнетения роста кишечной палочки), индикатор нейтральный красный. Шигеллы не разлагают лактозу, дают рост бесцветных, лактозоотрицательных колоний.

11. Определить вид микроба по антигенным свойствам в реакции агглютинации с адсорбированной агглютинирующей сывороткой.

Реакция агглютинации на стекле – склеивание нерастворимых АГ в виде частиц АТ.

Реакция агглютинации: 1. Ориентировочная (с неадсорбированной сывороткой. В не находятся группоспецифичные АТ к родственным видам бактерий)

2. Основная (с адсорбированной сывороткой. Содержится видоспецифические АТ)

Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На одну половину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия (контроль), а на другую – каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен агглютинации в пробах. Учет производят через 3-5 мин.

После учета реакции предметное стекло опускают в стакан с дезинфицирующим раствором.

12. Поставить и оценить ориентировочную реакцию агглютинации для определения вида микроба.

Реакция агглютинации на стекле – склеивание нерастворимых АГ в виде частиц АТелами.

Реакция агглютинации: 1. Ориентировочная (с неадсорбированной сывороткой. В ней находятся группоспецифические АТ к родственным видам бактерий) 2. Основная (с адсорбированной сывороткой. Содержатся видоспецифические АТ).Берут предметное стекло, делят стеклографом на две части: опытную (о) и контрольную (к). На опытную часть пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей сыворотки в разведении 1:5, на контрольную – каплю физиологического раствора. Затем в каждой капле тщательно размешивают небольшое количество культуры бактерий до получения гомогенной взвеси. Бактерии вносят прокаленной и остуженной бактериальной петлей. Петля стерилизуется после каждой капли. Результат наблюдают через 1-2 мин. Контрольная капля остается равномерно мутной. В опытной капле в положительном случае наблюдается склеивание бактерий в виде мелких зернышек.

13. Учесть результат ПЦР (Полимеразная цепная реакция)

Исследуемый материал, содержащий 2-спиральную нуклеиновую кислоту (ДНК), нагревают до 90-100⁰С, вызывая тем самым расхождение 2-х-цепочечной ДНК на отдельные цепи. В смесь добавляют набор всех пуриновых и пиримидиновых оснований, праймеры и термостабильную ДНК-полимеразу. Праймерами называются синтетические короткие участки ДНК, комплементарные той нуклеиновой кислоте, которую амплифицируют (копируют). Праймеры обычно располагаются с концов (фланкируют) амплифицируемый участок ДНК и служат затравками (инициаторами) полимеризации.

Реакционную смесь охлаждают (обычно до 70-76⁰С). Праймеры присоединяются к разошедшимся цепям. При этом термостабильная полимераза достраивает 2 разошедшиеся цепи ДНК до полных молекул, удваивая тем самым исходное количество генетического материала. Удвоенное количество генетического материала подвергают повторному расхождению и удвоению и так далее. Проведя несколько десятков циклов полимеризации, можно поднять содержание ДНК в исследуемом материале до порога обнаружения. После этого нуклеиновую кислоту выявляют обычной молекулярной гибридизацией.

ПЦР является самым чувствительным из имеющихся в настоящее время методов, позволяя обнаружить всего 100 молекул ДНК или РНК в 1 мл сыворотки. В случае определения молекул РНК (например – вируса ВИЧ) для проведения полимеразной цепной реакции предварительно получают его ДНК-копию с помощью фермента обратной транскриптазы. Затем ход реакции не отличается от вышеописанного.

14. Поставить реакцию преципитации для определения антигена в ликворе больного. Видео 11

Реакция кольцепреципитации – это взаимодействие растворимого АГ с АТ, в результате которого АГ выпадает в осадок в присутствии АТ.

Взять пробирку и осторожно по стенке внести пастеровской пипеткой около 0,5 мл преципитирующей менингококковой сыворотки. Затем аккуратно наслоить на сыворотку такое же количество ликвора так, чтобы ликвор не смешивался с сывороткой, а образовал над ней верхний слой. Пробирку поставить в штатив. При положительном результате сразу на границе обеих жидкостей образуется мутное кольцо преципитации.Кольцо преципитации – иммунный компекс АГ-АТ.

15. Оценить РПГА для определения наличия столбнячного токсина в фильтрате исследуемого материала (по демонстрационному материалу).

Оценивают результаты РПГА по характеру осадка эритроцитов. Отрицательная реакция – осадок компактный в виде колечка с ровными краями, «пуговица», положительная – характерный кружевной осадок в виде зонтика. Титр токсина – предельное разведение фильтрата, дающее положительный результат.

16. Поставить РГА для индикации и титрования вируса. Оценить реакцию по демонстрационному ряду.

РГА используется для индикации вируса.

Постановка реакции гемагглютинации для индикации и титрования вируса.

Разведения	1:5	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	К

Физ.раствор	0,8	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Аллантоисная жидкость	0,2	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	-
Взвесь эритроцитов	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0.4	0,4
Результат
Заключение:

Максимальное разведение аллантоисной жидкости, еще дающее гемагглютинацию (осадок в форме зонтика), принимается за титр гемагглютинирующего вируса.

17. Оценить РТГА в парных сыворотках больного с целью серодиагностики вирусных инфекций.

Используется для идентификации вируса. Берут 2 ряда пробирок с разведениями сыворотки больного: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, К (контроль). Учет начинают с контрольных пробирок, в которых должен быть осадок эритроцитов в виде «зонтика». Затем сравнивают результаты опытных пробирок с контролем. При наличии осадка эритроцитов в виде «пуговки» результат оценивается положительно, при наличии «зонтика» - отрицательно.

Определяют титры антител в двух рядах сыворотки и сравнивают.

Для серологического подтверждения вирусной инфекции титр антител во II-й сыворотке, взятой в конце заболевания, должен возрасти не менее, чем в 4 раза по сравнению с I-й сывороткой больного.

18. Поставить РПГА для определения титра антител в сыворотке больного. Оценить реакцию по демонстрационному ряду.

Используют стандартные антигенные эритроцитарные диагностикумы. В пробирках готовят последовательные разведения сыворотки больного, ориентируясь на диагностический титр. Затем в каждую пробирку вносят одинаковый объем 3% суспензии нагруженных антигеном эритроцитов (эритроцитарного диагностикума). Через 2 ч инкубации при 37⁰С учитывают результат, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): отрицательная реакция – осадок эритроцитов в виде компактного диска или колечка с ровными краями на дна лунки, положительная реакция – характерный кружевной вид осадка эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

19. Определить титр антител в ИФА по демонстрационному материалу.

Сначала оценивают контрольные пробы:

1. Отрицательная проба – лунка, в которой цвет пробы прозрачный со слегка желтоватым оттенком.

2. Положительная проба – лунка, в которой цвет среды коричневый.

После этого учитывают лунки, в которых находятся разведения исследуемой сыворотки (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.). За титр антител принимают последнее разведение, в котором цвет пробы совпадает с цветом положительной пробы.

20. Поставить опыт по определению чувствительности культуры микроорганизмов к антибиотикам методом бумажных дисков. Оценить опыт по демонстрационным посевам.

Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашке Петри. Для этого извлекают из бумажной упаковки стерильную пипетку, ее берут в правую руку. В левую руку берут пробирку с 1 млрд взвесью бактериальной культуры, открывают над спиртовкой пробку 4 –5 пальцами правой кисти. Набирают в пипетку 1 мл культуры, располагают пипетку горизонтально (чтобы случайно не вылить содержимое на стол), обжигают края пробирки и закрывают ее пробкой. Приоткрыв чашку Петри с МПА, выливают 1 мл культуры на агар. Чашку закрывают и распределяют культуру по поверхности агара, оставляют на несколько минут (для всасывания жидкости) на столе. Затем на поверхность питательной среды пинцетом помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37⁰С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста культуры судят об ее чувствительности к соответствующим антибиотикам. При зоне задержки роста диаметром 0-10 мм культура расценивается как нечувствительная (устойчивая), диаметром 11–15 расценивается как малочувствительная, 16-25 мм – чувствительная, больше 25 мм – высокочувствительная.

Метод полуколичественный, т.к. не можем определить минимальную ингибирующую концентрацию антибиотика.

21. Определение МПК (минимальной подавляющей концентрации) антибиотика методом серийных разведений в бульоне (по демонстрационному ряду).

Из основного раствора, содержащего определенную концентрацию антибиотиков, готовят ряд убывающих разведений антибиотиков в пробирках с бульоном и добавляют испытуемую культуру (обычно 10⁵-10⁶ бактериальных клеток). Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотиков. Срок инкубации зависит от вида микроорганизмов (чаще сутки). Определяют МПК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда).

Метод является количественным, т.к. можем определить минимальную ингибирующую концентрацию.

Что такое МИК - наименьшая концентрация антибиотика, угнетающая рост микроорганизмов при культивировании. Что такое МБК (минимальная бактерицидная концентрация) – наименьшая концентрация препарата, вызывающая бактерицидный эффект.

22. Среда Эндо.

Среда Эндо – МПА, 1% лактоза, индикатор (основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия). Колонии микроорганизмов, разлагающих лактозу, приобретают цвет индикатора (красные). Используется для культивирования Энтеробактерий. Кишечная палочка расщепляет лактозу. Происходит изменение цвета, т.к. в кислой среде происходит восстановление цвета фуксина. Образуются колонии бордового цвета с металлических блеском.

23. Среда Плоскирева.

24. Среда Гисса.

Среды Гисса используют для изучения биохимических свойств выделенной культуры. Они представлены рядом пробирок с пептонной водой, 1% раствором углевода (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, спирт маннит), индикатором Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный 1М NаOH), поплавком для улавливания газа. Если углевод разлагается до кислоты, щелочь нейтрализуется, фуксин восстанавливается, среда краснеет, если до газа, то в поплавке появляется пузырек газа.

25. Среда Китта–Тароцци (коричневая)

Используется для выращивания строгих (облигатных) анаэробов, состоит из МПБ, кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода из среды, глюкозы (источник энергии), сверху залита вазелиновым маслом для защиты от кислорода. Используется для культивирования клостридий (возб. Столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

26. Среда Ресселя (Зеленая)

Сложная дифференциально-диагностическая среда. Состоит из МПА, 1% лактозы, 0,1% глюкозы и индикатора. Среда имеет форму полускошенного агара.

Применяется для выделения чистой культуры бактерий (энтеробактерий) и дифференциации их по биохимическим свойствам.

Проводят укол в столбик по скошенной поверхности:

1. Если расщепляет только глюкозу, то происходит изменение цвета только в анаэробных условиях. 2. Если расщепляет и глюкозу и лактозу, то происходит изменение цвета всей среды.

27. Среда Кесслера. Состав среды Кесслера: 1% пептонная вода, 5% желчи, 0,25% лактозы, генциановый фиолетовый для подавления роста грамположительных бактерий. Используется для обнаружения свежего фекального загрязнения в смыве с рук.

28. ЖСА (Желточно-солевой агар) Элективная среда, для культивирования стафилококка. Состав: МПА, NaCl 10%, желток (для определения лецитиназы). Зоны помутнения – лецитиназная активность. Образуются золотистые колонии с зонами помутнения.