Определение продукции гидролитических ферментов

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена. Техника: 1. Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на него наносят карболовый раствор фуксина, приготовленный по Цилю.2. Мазок с красителем 2 – 3 раза подогревают до появления паров, держа его в пламени спиртовки. 3. Препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают водой. 4. Окрашенный мазок обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты (препарат помещают 2 – 3 раза в стаканчик с кислотой, не задерживая в ней). 5. Препарат промывают водой и докрашивают на протяжении 3 – 5 мин метиленовым синим по Леффлеру. 6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые – в синий.

Эндоспоры бактерий

Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desufotomaculum, etc.

метод Шефера – Фултона.Техника: 1. Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который наносят 0,5 % водный раствор малахитового зеленого и 2 – 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления паров.

2. Фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают водой и в течение 30 с докрашивают 0,5 % раствором сафранина.

3. Препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетка – в красный.

Капсула бактерий

метод Гинса – Бурри (метод негативного контрастирования).

Техника:1. На предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий. 2. Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок как мазок крови (ребром одного стекла проводят по поверхности другого). 3. Мазок высушивают на воздухе.4. Микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой. На темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой.

Цитоплазматические включения

Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии Окраска гранул волютина по Нейссеру. Техника: 1. На фиксированный мазок наносят 2 – 3 капли раствора метиленового синего по Нейссеру и окрашивают в течение 1 – 2 мин.2. Краситель сливают, препарат промывают водой. 3. Мазок обрабатывают раствором Люголя в течение 20 – 30 с. 4. Не промывая препарат водой, мазок дополнительно окрашивают2 – 3 мин 2 % раствором везувина. 5. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, используя иммерсионную систему. Цитоплазма окрашивается в желтый цвет, а гранулы волютина – в темно-синий.

Подвижность бактерий

Техника: 1. Выращенные на скошенном агаре бактерии, осторожно ресуспендируют в пептонной воде. Бактериальной петлей суспензию наносят на предметное стекло и высушивают на воздухе.

2. Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник.

3. Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя таким образом, чтобы он не вытекал за пределы восковой линии. Оставляют краситель на определенное время (до 1 часа). В состав красителя входят 1,5 % хлористого натрия, 3 % таннина (дубильной кислоты) и

0,03 % фуксина.

4. Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка, а по всему мазку выпадет осадок, краситель удаляют под струей воды, а препарат высушивают на воздухе.

5. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Определение способности микроорганизмов использовать углеводы и спирты на средах Гисса. В состав сред Гисса входят:

· Основной фон (в %, пептон – 0,5; К₂НРО₄ – 0,1);

· Индикатор (бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, феноловый красный);

· Исследуемый углевод или спирт (1 %).

 

Определение продукции гидролитических ферментов

Определение протеолитической активности заключается в выявлении протеаз, которые катализируют расщепление белков на поли- и олигопептиды. Активность последних определяют, используя в качестве субстратов, желатину, казеин и другие белки.

Разжижение желатины. С помощью бактериологической петли биомассу исследуемого материала засевают уколом в питательную мясопептонную желатину, приготовленную следующим образом: к жидкой полноценной среде добавляют сухую желатину (12 %), размачивают до набухания, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворения желатины и разливают в пробирки по 5 – 8 мл. Пробирки стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Посев производят после застывания столбиков и микроорганизмы инкубируют при оптимальной температуре 24 – 72 часа.

Разжижение желатины регистрируют визуально, при этом отмечают интенсивность и характер разжижения, которое может быть послойным, мешковидным, пузыристым, в виде ели, повернутой верхушкой вниз и т. д.

О наличии протеолитических ферментов может свидетельствовать и гидролиз казеина. В этом случае обезжиренное (0,3 – 0,5 %) молоко смешивают с питательной средой и определяют образование сгустков, осадка и др.

Определение амилолитической активности заключается в посеве микроорганизмов на поверхность полноценной питательной среды, которая содержит 0,2 % растворимого крахмала. Через 3 – 5 суток инкубирования на поверхность среды в чашках Петри наносят раствор Люголя. При отрицательной реакции поверхность остается синей. Если бактерии гидролизуют крахмал, то питательная среда не окраши-
вается.