Методы изучения ферментативной активности (биохимических свойств). Использование ее для идентификации бактерий.

 

В микробиологической практике изучение ферментативной ак­тивности используют для идентификации микроорганизмов, посколь­ку каждый микробный вид обладает определенным набором фермен­тов.

Для определения протеолитической активности микробы засева­ют уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина: в виде воронки, гвоздя, чулка или в виде опрокинутой елки. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения засевают микроорганизмы в мясо-пептонный бульон, и между горлыш­ком пробирки и ватной пробкой помещают индикаторные бумажки, исключая их контакт со средой. При образовании индола бумага, про­питанная насыщенным раствором щавелевой кислоты, приобретает розовый цвет; в присутствии сероводорода бумага, пропитанная аце­татом свинца, чернеет; при образовании аммиака красная лакмусо­вая бумажка синеет.

Для определения сахаролитических свойств микробов применяют дифференциально-диагностические среды такие, как среды Гисса, среда Олькеницкого, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде - индикатор рН. Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, на­пример кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы об­разуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. По­этому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашенны­ми соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоски­рева - в красный цвет, на среде Левина - в черно-синий. Колонии бак­терий, не сбраживающих лактозу, таких как сальмонеллы и палочки дизентерии, будут бесцветными.

Среды Гисса (среды "пестрого ряда") готовятся на основе пептон-ной воды или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо один углевод или многоатомный спирт и индикатор. При росте на среде Гисса микроба, сбраживающего данный субстрат с образо­ванием кислоты и газа, среда изменит цвет, в полужидкой среде по­явятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырек газа в стеклянном поплавке. При сбраживании субстрата только до кислоты происходит лишь изменение цвета среды.

Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого. Одна пробирка этой среды заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глю­козой и сахарозой. После стерилизации в расплавленном виде среду в пробирке скашивают так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании лактозы или сахарозы изменяется цвет всей среды, при сбраживании одной глюкозы изменяется цвет только столбика. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике ага­ра. При выделении микробами аммиака цвет среды не меняется. Образование сероводорода проявляется почернением в столоике агара

Для экспресс-метода определения ферментативной активности бак­терий применяются микротестсистемы и система индикаторная бумаж­ная (СИБ)

Микротестсистема представляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек Ячейки содержат высу­шенные питательные среды с углеводами и индикаторами рН В каж­дую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определенной густо­ты В контрольные ячейки наливают физ раствор Результат учитыва­ют после 3 - 4-хчасовой инкубации в термостате по изменению цвета

индикатора

Системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации се­мейства энтеробактерий представляет собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной пленкой и содержащие определенный субстрат и индикатор В пробирки с физиологическим или буферным раствором вносят исследуемую культуру, затем поме­щают диски В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят Результат учитывают по изменению цвета индикатора Для определе­ния сероводорода диск помещают на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность

Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный - на следующий день

Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бумажке Результат учитывается через минуту.

3. Дыхание бактерий. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления. Классификация бактерий по типу дыхания.

Дыхание бактерий

Дыхание является самой совершенной формой окислительного процесса и наиболее эффективным способом получения энергии. Главное преимущество дыхания состоит в том, что энергия окисляемого вещества -- субстрата, на котором микроорганизм растет, используется наиболее полно. Поэтому в процессе дыхания перерабатывается гораздо меньше субстрата для получения определенного количества энергии, чем, например, при брожениях.

Процесс дыхания заключается в том, что углеводы (или белки, жиры и другие запасные вещества клетки) разлагаются, окисляясь кислородом воздуха, до углекислого газа и воды.

Выделяющаяся при этом энергия расходуется на поддержание жизнедеятельности организмов, рост и размножение.

Аэробные Бактерии

Аэробные бактерии - те бактерии, которые требуют кислорода для их основного(элементарного) выживания, роста и процесса воспроизводства. Очень легко изолировать эти бактерии культивированием масса бактериальных штаммов в некоторой жидкой(ликвидной) среде. Вследствие факта, что они требуют кислорода для выживания, они имеют тенденцию(склонны) прибывать(приезжать) в поверхность в предложении получить максимальный доступный кислород. Bacillus и Nocardia среди лучших примеров аэробных видов бактерий.

Анаэробные Бактерии

Анаэробные бактерии, также называемые анаэробами, являются теми бактериями, которые не требуют кислорода для процесса роста. Есть различные типы анаэробных видов бактерий, включая аеротолерэнт анаэробов, которые могут выжить в присутствии кислорода, и обязывать анаэробов, которые не могут выжить в присутствии кислорода. Эшеричия Коли и бактероиды - лучшие примеры анаэробных видов бактерий.

Дыхание (или биологическое окисление) — это сложный процесс, который сопровождается выделением энергии, необходимой микроорганизмам для синтеза различных органических соединений. Бактерии, как и высшие животные, для дыхания используют кислород. Однако Л. Пастером было доказано существование таких бактерий, для которых наличие свободного кислорода является губительным, энергия, необходимая для жизнедеятельности, получается ими в процессе брожения.

Все бактерии по типу дыхания подразделяются на об-лигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы.

Облигатные (строгие) аэробы развиваются при наличии в атмосфере 20% кислорода (микобактерии туберкулеза), содержат ферменты, с помощью которых осуществляется перенос водорода от окисляемого субстрата к кислороду воздуха.

Микроаэрофилы нуждаются в значительно меньшем количестве кислорода, и его высокая концентрация хотя и не убивает бактерии, но задерживает их рост (актиноисцеты, бруцеллы, лептоспиры).

Факультативные анаэробы могут размножаться как в присутствии, так и в отсутствие кислорода (большинство патогенных и сапрофитных микробов — возбудители брюшного тифа, паратифов, кишечная палочка).

Облигатные анаэробы — бактерии, для которых наличие молекулярного кислорода является губительным (клостри-дии столбняка, ботулизма).

Аэробные бактерии в процессе дыхания окисляют различные органические вещества (углеводы, белки, жиры, спирты, органические кислоты и пр.).

Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием небольшого количества энергии. Процессы разложения органических веществ в безкислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют брожением. В зависимости от участия определенных механизмов различают следующие виды брожения: спиртовое, осуществляемое дрожжами, молочно-кислое, вызываемое мол очно-кислыми бактериями, масляно-кислое и пр.

С выделением большого количества тепла при дыхании некоторых микроорганизмов связаны процессы самовозгорания торфа, навоза, влажного сена и хлопка.