Характеристика микробного сообщества почвы

Министерство образования и науки РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

Специальность: 012400 (ОКСО 020209) – микробиология

 

Отчёт

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ

Выполнили:

Студенты 3 курса

Группы 102

Липатникова А.А.

Данилова М.А.

 

Преподаватели:

Зеленихин П.В.

Мочалова Н.К.

 

Казань - 2013

ВВЕДЕНИЕ

П о чвенные микроорган и змы- совокупность разных групп микроорганизмов, для которых естественной средой обитания служит почва. Почвенные микроорганизмы играют важную роль в круговороте веществ в природе, почвообразовании и формировании плодородия почв. П. м. могут развиваться не только непосредственно в почве, но и в разлагающихся растительных остатках. В почве встречаются также некоторые болезнетворные микробы, водные микроорганизмы и др., которые случайно попадают в почву (при разложении трупов, из желудочно-кишечного тракта животных и человека, с поливной водой или др. путями) и, как правило, быстро в ней погибают. [ Виноградский С. Н., Микробиология почвы, М., 1952 ]

Цель работы: охарактеризовать микробное сообщество почвы.

Используемые материалы: пробирки с 9 мл водопроводной воды, колба с 45 мл водопроводной воды, чашки Петри, пипетки с отколотыми концами, среды – МПА, Гаузе, Чапека, Эшби, Гетчинсона (твердые), Гильтея и Виноградского I и II (жидкие).
Ход работы:

Подготовка сред:

1. МПА МПБ, агар – 20 г/л

2. Среда Чапека (г/л), pH 4,2-4,5:

Компонент:	Масса, г:
Сахароза	30,0
NaNO3	2,0
KH2PO4	1,0
MgSO4*7H2O	0,5
KCl	0,5
FeSO4	0,01
CaCO3	3,0
агар-агар	20,0
дист. вода	1000,0
молочная кислота	2 мл/л

3. Среда Гаузе, (г/л) pH=7,2-7,4

Компонент:	Масса, г:
крахмал	20,0
K2HPO4	0,5
MgSO4	0,5
KNO3	1,0
NaCl	0,5
FeSO4	00,1
агар-агар	20,0
дист. вода	1000,0

4. Среда Эшби (г/л)

Компонент:	Масса, г:
Сахароза, или маннит	20,0
K2HPO4	0,2
MgSO4*7H2O	0,2
KH2PO4	0,1
NaCl	0,2
CaCO3	0,5
агар-агар	20,0
дист. вода	1000,0

5. Среда Гетчинсона (г/л), pH=7,2-7,3:

Компонент:	Масса, г:
K2HPO4	1,0
CaCl2*6H2O	0,1
MgSO4*7H2O	0,3
NaCl	0,1
FеCl3*6H2O	0,01
NaNO3	2,5
агар-агар	20,0
дист. вода	1000,0

 

6. Среда Гильтея (г/л). Готовят два раствора:

Компонент:	Масса, г:
I) KNO3	2.1
аспарагин	1.0
дист.вода
II) Лимоннокислый натрий	5.0
KH2PO4	2.0
MgSO4*7H2O	2.0
CaCl2	2.0
FеCl3	0.01
дист.вода

· после растворения солей растворы сливают вместе;

· устанавливают pH 6,8 - 7,0;

· доводят объем до 1000 мл;

· добавляют индикатор (бромтимоловый) синий до появления зеленого цвета;

· среду разливают по 9 мл в пробирки, опускают поплавки для улавливания газов и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин.

7. Среда Виноградского (г/л):

Для первой фазы нитрификации:	Для второй фазы нитрификации:
Компонент:	Масса, г:	Компонент:	Масса, г:
(NH4)2SO4	2,0	NaNO2	1,0
K2HPO4	1,0	Na2CO3	1,0
MgSO4*7H2O	0,5	NaCl	0,5
NaCl	2,0	K2HPO4	0,5
FeSO4	0,4	MgSO4*7H2O	0,3
CaCO3	5,0	FeSO4	0,4

1) Взвешиваем 5 г почвы (образец № 2), используя стерильный шпатель, и помещаем почву в ступку, предварительно простерилизованную методом фламбирования, наливаем из колбы немного воды, растираем почву пальцем, надев резиновый напальчник, очищаем от посторонних фрагментов и очищенную гомогенную почвенную массу перемещаем обратно в колбу с 45 мл воды (перед этим производим посев на среды Гетчинсона и Эшби, выкладывая кусочки почвы в шахматном порядке). В течение 3 минут круговыми движениями перемешиваем почву.

2) Далее производим ряд разведений – пипеткой переносим 1 мл почвенной вытяжки из колбы в пробирку с 9 мл воды, перемешиваем и переносим 1 мл жидкости в следующую пробирку. Таким образом доводим до разведения 10־⁸.

3) Далее производим посев на среды:

o Глубинный посев на МПА из разведения 10־⁸. Ставим в термостат на 28°С на 72 часа, после чего производим визуальный анализ колоний и микроскопируем препараты «раздавленная капля», «висячая капля» и «фиксированный мазок».

o Посев газоном на Гаузе и Чапека из разведения 10־². Чашки Петри со средой Чапека инкубируют при 24-26°C 3-5 суток, со средой Гаузе – при 28°С 14 суток.

o В среды Гильтея, Виноградского I и Виноградского II вносим 1 мл суспензии из разведения 10־⁴, В среде Гильтея должны находиться стеклянные поплавки или кусочки ваты, после посева среду Гильтея заливаем 0,5-1 мл вазелина для создания анаэробных условий. Инкубируем при температуре 28-35°С, учет изменений производим через 7, 14, 21 дней.

o На теплую, но уже застывшую среду Гетчинсона выкладываем диски из фильтровальной бумаги, после чего на неё и на среду Эшби выкладываем по 25-30 комочков почвы в шахматном порядке, избегаю слишком близкого расположения. Инкубации производится во влажной камере при температуре 28-30° в течение 2-х недель.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

1. Учет бактерий на мясо-пептонном агаре (МПА)

Описание колоний

№	Размер, см	Форма	Край	Цвет	Структура	Микроорганизм
	0,7	Круглая	Ровный	Кремовый, бежевый, белое пятно в середине	Неоднородная	Актиномицет
	0,9	Круглая	Ровный	Розовато- кремовый	Однородная	Бациллы, короткие палочки средней толщины, собраны в пары, с округлыми краями
	0,4	Круглая	Неровные, волнистые, округлые	Телесно – бежевый	Однородная, волокнистая	Бациллы, среднего размера, с закругленными краями
	1,3	Неровный круг	Неровные, обрывистые, волнистые	Жемчужно- розовый	Посередине однородная, по краям волокнистая, морщинистая	Палочки в цепочках, средние, бочковидные, со спорами
	1,1	Круглая	Ровные	Цвет слоновой кости	Однородная	Бациллы, толстые, крупные, с прозрачными вышедшими спорами
		Неровный круг	Мелко - зубчатые	Бледно - желтый	Однородная, слегка зерниста	Бациллы со спорами, расположенными ближе к полюсу. Есть тонкие, есть толстые, расположены попарно.

 

 

	1-0.5	овальная	перистый	Белый	Волоскнистая	B. micoides
	0.5	округлая	неровный волнистый	Нежно-розовый	Складчатая	Очень мелкие палочки
		округлая	ровный	Бледно-голубой	Ровная, однородная	Микрококки, диплококки
		округлая	ровный	Бледно-белый	Вогнутая	Средних размеров пачлочки, спор не обнаружено
	0.3	округлая	ровный	Кремово-розовый	Выпуклая	Сарцины
	0.5	округлая	ровный	Ярко-желтый	Скалдчатая, не блестит	Небольшие палочки, спор не обнаружено, распологаются поодиночке
		округлая	неровный волнистый	Серовато-белый	Складчатая, блестит	Палочки со спорами

Количество микроорганизмов на 1 г воздушно-сухой почвы:

а = б*в*10/г, где:

а - число клеток в микроорганизмов на 1 г воздушно-сухой почвы;

б - среднее число выросших колоний;

в - соответствующее разведение;

10 -коэффициент пересчета на 1 г почвы;

г - содержание абсолютно сухой почвы на 1 г исходной почвы.

Среднее количество колоний 105.

2. Учет микромицетов на среде Чапека

№	Воздушный мицелий	Субстратный пигмент
	Белый	Желтый, яркий
	желтый	желтый

Расчет количества грибных зачатков в почве:

а- число грибных зачатков на 1г почвы;

б- среднее кол-во колоний на чашках;

в- разведение;

г- кол-во капельв 1 мл суспензии;

д- вес почвы, взятой на анализ.

Среднее количество колоний 37.

3. Учет актиномицетов на среде Гауза

Колония №	Субстратный мицелий	Воздушный мицелий	Пигмент	Микроскопия
	Шоколадно - коричневый	Бледно - розовый	-
	Темно-коричневый	Белый, чистый	-
	Темно - зеленый	Бежево - коричневый	-
	Бежево – коричневый	Бежево - кремовый	-

Расчет количества грибных зачатков в почве:

а- число грибных зачатков на 1г почвы, б- среднее кол-во колоний на чашках, в- разведение, г- кол-во капель в 1 мл суспензии, д- вес почвы, взятой на анализ.

Среднее количество колоний 14.

4. Выделение азотобактера методом посева почвенных комочков на агаризованную среду Эшби

Перед микроскопирование делаем окраску по Гимсу:

1.На обезжиренное предметное стекло помещается капля черной туши, в которую вносится культура;

2. Тушь растирается при помощи другого стекла, мазок высушивается и фиксируется в смеси Никифорова в течение 5-10 минут;

3. После производится окраска фуксином цилия (1:3) 2-3 минуты, затем краситель смывается водопроводной водой.

Микроскопируем с иммерсией.

На темном фоне малиновые клетки, расположенные попарно, вокруг них находится капсула.

Процент содержания азотобактера (Х):

а – общее кол-во комочков почвы;

в – число комочков с ростом азотобактера.

Х = 100%

5. Определение аэробных целлюлозоразрушающих бактерий в почве методом посева комочков

Тип разрушения целлюлозы: изменение цвета – становится желтой, бурой, коричневой, происходит рост грибов.

Микроскопия:

1.

 

 

Мицелий без спор.

2.

 

 

Мицелий, споры Fusarium или Aspergillus.

Процент содержания целлюлозоразрушающих бактерий: 100%.

 

6. Наблюдение денитрификации и получение накопительной культуры на среде Гильтея

Денитрификация

1. Диссимиляционная денитрификация;

2. Ассимиляционная денитрификация.

Цвет среды Гильтея из зеленого превратился в голубой, что говорит об изменении pH среды, так как в процессе ассимиляционной денитрификации образуется аммоний; в стеклянном колпачке скапливается газ – азот, что говорит о прохождении процесса диссимиляционной денитрификации.

Для определения продуктов жизнедеятельности денитрифицирующих бактерий из культуральной жидкости делают пробы:

1. На нитрат (NO₃) с дифениламином;

2. На нитрит (NO₂) с цинк-йод-крахмалом или реактивом Грисса;

3. На аммиак (NH₃) с реактивом Несслера.

	Дефиниламин + H2SO4	Реактив Грисса	Реактив Несслера
7 суток	мало	нет	есть
14 суток	нет	нет	есть
21 суток	нет	нет	есть

Это говорит о том, что в среде процесс денитрификации идет очень быстро, и нитраты быстро восстанавливаются бактериями до аммония и азота.

При микроскопировании (фиксированный препарат) обнаружились мелкие палочки, Pseudomonas.

7. Выделение нитрифицирующих бактерий из среды Виноградского I и II

	Дефиниламин + H2SO4	Реактив Грисса	Реактив Несслера
Среда Виноградского I
7 суток	нет	мало	немного
14 суток	мало	есть	есть
21 суток	есть	есть	есть
Среда Виноградского II
7 суток	есть	есть	нет
14 суток	есть	есть	нет
21 суток	есть	нет	нет

Это говорит о том, что процесс нитрификации идет крайне медленно.
При микроскопировании (фиксированный препарат) обнаружились кокки, бациллы: Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus, Bacillus.