Атомная силовая микроскопия и её применение для анализа тонкой структуры биологических макромолекул и надмолекулярных образований.

Атомно-силовая микроскопия

Атомно-силовой микроскоп был изобретён в 1986 году Герхардом Биннигом, Калвином Куэйтом и Кристофером Гербером на основе идей, заложенных Герхардом Биннигом и Хайнрихом Рорером (Нобелевская премия по физике, 1986 год). С помощью атомно-силового микроскопа можно получать изображения как физических объектов (поверхности твёрдых тел, рис.1), так и биологических и химических объектов (вирусов и бактерий, атомов и молекул). Разрешение таких микроскопов достигает доли нанометров, что позволяет наблюдать атомы! Получением изображений не ограничиваются возможности этого прибора. С помощью атомно-силового микроскопа можно изучать взаимодействие двух объектов: измерять силы трения, упругости, адгезии, а также перемещать отдельные атомы, осаждать и удалять их с какой-либо поверхности.

Атомно-силовая микроскопия – вид зондовой микроскопии, в основе которого лежит силовое взаимодействие атомов (строго говоря обменное взаимодействие атомов зонда и исследуемого образца).

Рассмотрим подробнее, какие силы действуют между зондом и исследуемой поверхностью. Для начала обратимся к взаимодействию двух атомов (молекул).

На небольших расстояниях все атомы и молекулы притягиваются. Это притяжение имеет чисто квантовую природу. Оно связано с коррелированными, то есть согласованными колебаниями электронов в обоих атомах. Энергия пары атомов, где электроны смещены (поляризованы) одинаковым образом, — чуть меньше, чем энергия пары неполяризованных атомов. И энергия эта спадает с расстоянием между атомами как 1/r⁶.

Общая энергия взаимодействия атомов приближённо описывается формулой Леннарда-Джонса (потенциал типа (6-12)):

U(r)=E₀((r_min/r)¹²-(r_min/r)⁶)

Здесь первое слагаемое отвечает за отталкивание, оно начинает “работать” при малых расстояниях, когда вторым, притяжением, уже можно пренебречь (рис.2). При этом r₀ - это расстояние между атомами, соответствующее минимальной энергии системы, то есть наиболее выгодной, а r_min – расстояние, при котором энергия взаимодействия обращается в нуль. Характерные параметры Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий приведены в таблиц

Силу взаимодействия зонда с образцом можно получить, если просуммировать все такие элементарные взаимодействия для каждого атома зонда. Для зонда, характеризующегося некоторым радиусом кривизны R (R>>z, где z – расстояние от зонда до поверхности, рис.3) и абсолютно плоского образца, в приближении механики сплошных сред сила притяжения будет пропорционально R/z² (формула Гамакера),отталкивания– примерно 1/z⁸.

Для того, чтобы “почувствовать” данное взаимодействие атома с атомом, необходимо, чтобы зонд был атомных размеров. Реальные зонды имеют размеры от десятка нанометров до размера одного атома! Их длина составляет 1-2 мкм.

Зонд (остриё, игла) расположен на свободном конце кантилевера (или консоли, рис.4). Зонды в основном изготавливают из таких материалов, как кремний Si и Si₃N₄. Чем меньше радиус кривизны и угол схождения острия, тем меньше его влияние на получающееся изображение исследуемого объекта. Консоль – это упругая пластинка, по отклонению которой в принципе можно судить о силе взаимодействия острия с образцом (закон Гука: F=kz).

Когда остриё приближается к образцу, между ними начинают действовать силы обменного взаимодействия. В зависимости от того, насколько мало расстояние между остриём и образцом, это будет сила либо притяжения либо отталкивания. Отсюда и возникают два разных режима сканирования – контактный и бесконтактный.

При контактном режиме, или режиме отталкивания, остриё настолько близко подходит к исследуемому образцу, что говорят о так называемом “физическом контакте”. При этом сила отталкивания уравновешивается силой упругости консоли и капиллярной силой, которая с неизбежностью возникает, когда измерение проводят на воздухе: зонд “протыкает” тонкий слой влаги, который адсорбируется на образце. Константа упругости консоли в этом режиме должна быть достаточно маленькой, для того чтобы зонд деликатно отслеживал профиль поверхности, не разрушая её.

Рельеф исследуемой поверхности формируется, как правило, либо в режиме постоянной высоты, либо в режиме постоянной силы. В первом случае кантилевер передвигается в горизонтальной плоскости, и регистрируется его отклонение в каждой точке. Во втором случае с помощью системы обратных связей постоянным поддерживается отклонение (прогиб) кантилевера, т.е. сила взаимодействия его с образцом. Передвижение образца или кантилевера происходит с помощью пьезоэлектрического манипулятора.

Ещё один часто используемый режим – режим прерывистого контакта или tapping mode – во многих случаях (в основном, при исследовании мягких материалов, таких как полимерные цепи и различные биообъекты) позволяет повысить качество получаемого изображения. При таком способе сканирования с помощью ещё одного пьезоэлектрического манипулятора осуществляются вынужденные механические колебания кантилевера с частотой, близкой к резонансной (обычно это десятки и сотни килогерц) и с амплитудой порядка 100 нм. В нижней точке колебаний остриё “касается” образца. В этом режиме, как и в любом контактном режиме, возможно проминание образца иглой. При передвижении сканирующей иглы (или образца) отслеживается изменение резонансной амплитуды кантилевера (она зависит от внешней силы). Данный метод позволяет повысить разрешение микроскопа при наблюдении объектов с пониженной механической жёсткостью, поскольку здесь устранено влияние капиллярных сил. При таком методе также исключаются различные латеральные силы и силы трения, которые могут приводить к смещению структур на плоскости образца.

Бесконтактный режим “работает” на Ван-дер-Ваальсовом притяжении. Значит, расстояние между зондом и образцом должно быть не такое маленькое (чтобы отталкивание уже не играло большую роль) и не такое большое (это взаимодействие быстро спадает с расстоянием). Поскольку наклон кривой энергии Ван-дер-Ваальсового притяжения меньше, чем в области отталкивания, то и силы притяжения меньше сил отталкивания (F~tg = ). А поскольку в этом режиме константа упругости консоли уже должна быть, наоборот, большая (чтобы не происходило залипания зонда к образцу), то для получения качественного изображения необходима более чувствительная схема детектирования вертикального перемещения кантилевера. Вертикальные отклонения измеряются, например, высокоточными оптическими методами (лазерный луч отражается в зеркале, закреплённом на кантилевере, и регистрируется фотодиодом). Данный режим по сравнению с предыдущими двумя используется не так часто.

Наглядное трёхмерное изображение поверхности получается лишь после соответствующей математической обработки цифровой информации, в качестве которой выступают двумерные массивы целых чисел, например, отклонения кантилевера. Существует множество разных алгоритмов обработки, необходимость использования которых зависит от цели экспериментатора и от конкретной ситуации. Ведь процесс сканирования идеальным не бывает – обязательно появляются различные флуктуационные выбросы, которые надо как-то сглаживать или фильтровать. Приходится также учитывать тепловой дрейф образца или нелинейности пьезокерамического манипулятора. Разумеется, всю вычислительную работу выполняет компьютер и выдаёт в качестве результата уже готовое изображение.

Важную роль в получении хорошего изображения в АСМ играет приготовление образцов. В ряде случаев особого приготовления образцов не требуется (например, при наблюдении поверхности графита). Однако при работе с (био)химическими веществами и молекулами, их обычно каким-то образом адсорбируют на подложке. Например, для наблюдения ДНК, её наносят на поверхность слюды, модифицированной ионами двухвалентных металлов.

Хорошее качество изображения молекул получается, когда они погружены в жидкость (обычно воду). Это происходит потому, что в воде заметно снижаются силы взаимодействия между зондом и образцом, а, следовательно, не происходит “залипания”. Наблюдение в водных средах позволяет исследовать процессы in vitro, например, самосборку актиновых филаментов.

Большой интерес представляет собой изучение с помощью атомно-силового микроскопа живых биологических объектов – бактерий, вирусов, клеток. Уже есть работы, в которых напрямую наблюдали динамику того или иного процесса, например, образование микропор в бактериальной стенке при воздействии ионов кальция. Такое использование АСМ также перспективно в медицине, например, для получения экспресс-анализов и диагностики заболеваний. На рис.6 представлено изображение бактерий Klebsiella.

С понятием зондовой микроскопии связано осуществление многовековой мечты человечества – увидеть атомы. Атомно-силовая микроскопия (как и в целом зондовая микроскопия) – относительно новое направление (а точнее, метод) в науке, и его использование кажется сейчас просто безграничным.

Теория распознава́ния о́бразов — раздел кибернетики, развивающий теоретические основы и методы классификации и идентификациипредметов, явлений, процессов, сигналов, ситуаций и т. п. объектов, которые характеризуются конечным набором некоторых свойств и признаков. Такие задачи решаются довольно часто, например, при переходе или проезде улицы по сигналам светофора. Распознавание цвета загоревшейся лампы светофора и знание правил дорожного движения позволяет принять правильное решение о том, можно или нельзя переходить улицу в данный момент.

Создание искусственных систем распознавания образов остаётся сложной теоретической и технической проблемой. Необходимость в таком распознавании возникает в самых разных областях — от военного дела и систем безопасности до оцифровки всевозможных аналоговых сигналов.

Традиционно задачи распознавания образов включают в круг задач искусственного интеллекта.

Направления в распознавании образов

Можно выделить два основных направления^[1]:

§ Изучение способностей к распознаванию, которыми обладают живые существа, объяснение и моделирование их;

§ Развитие теории и методов построения устройств, предназначенных для решения отдельных задач в прикладных целях.

[править]Формальная постановка задачи

Распознавание образов — это отнесение исходных данных к определенному классу с помощью выделения существенных признаков, характеризующих эти данные, из общей массы несущественных данных.

При постановке задач распознавания стараются пользоваться математическим языком, стараясь, в отличие от теории искусственных нейронных сетей, где основой является получение результата путем эксперимента, заменить эксперимент логическими рассуждениями и математическими доказательствами^[2].

Наиболее часто в задачах распознавания образов рассматриваются монохромные изображения, что дает возможность рассматривать изображение как функцию на плоскости. Если рассмотреть точечное множество на плоскости , где функция выражает в каждой точке изображения его характеристику — яркость, прозрачность, оптическую плотность, то такая функция есть формальная запись изображения.

Множество же всех возможных функций на плоскости — есть модель множества всех изображений . Вводя понятие сходства между образами можно поставить задачу распознавания. Конкретный вид такой постановки сильно зависит от последующих этапов при распознавании в соответствии с тем или иным подходом.

[править]Методы распознавания образов

Для оптического распознавания образов можно применить метод перебора вида объекта под различными углами, масштабами, смещениями и т. д. Для букв нужно перебирать шрифт, свойства шрифта и т. д.

Второй подход — найти контур объекта и исследовать его свойства (связность, наличие углов и т. д.)

Ещё один подход — использовать искусственные нейронные сети. Этот метод требует либо большого количества примеров задачи распознавания (с правильными ответами), либо специальной структуры нейронной сети, учитывающей специфику данной задачи.

[править]Персептрон как метод распознавания образов

Ф. Розенблатт вводя понятие о модели мозга, задача которой состоит в том, чтобы показать, как в некоторой физической системе, структура и функциональные свойства которой известны, могут возникать психологические явления — описал простейшие эксперименты по различению. Данные эксперименты целиком относятся к методам распознавания образов, но отличаются тем, что алгоритм решения не детерминированный.

Простейший эксперимент, на основе которого можно получить психологически значимую информацию о некоторой системе, сводится к тому, что модели предъявляются два различных стимула и требуется, чтобы она реагировала на них различным образом. Целью такого эксперимента может быть исследование возможности их спонтанного различения системой при отсутствии вмешательства со стороны экспериментатора, или, наоборот, изучение принудительного различения, при котором экспериментатор стремится обучить систему проводить требуемую классификацию.

В опыте с обучением персептрону обычно предъявляется некоторая последовательность образов, в которую входят представители каждого из классов, подлежащих различению. В соответствии с некоторым правилом модификации памяти правильный выбор реакции подкрепляется. Затем персептрону предъявляется контрольный стимул и определяется вероятность получения правильной реакции для стимулов данного класса. В зависимости от того, совпадает или не совпадает выбранный контрольный стимул с одним из образов, которые использовались в обучающей последовательности, получают различные результаты:

1. Если контрольный стимул не совпадает ни с одним из обучающих стимулов, то эксперимент связан не только с чистым различением, но включает в себя и элементы обобщения.

2. Если контрольный стимул возбуждает некоторый набор сенсорных элементов, совершенно отличных от тех элементов, которые активизировались при воздействии ранее предъявленных стимулов того же класса, то эксперимент является исследованием чистого обобщения.