Сложные белки ХРОМОПРОТЕИНЫ

Хромопротеины (от греч. chroma-краска) состоят из простого белка и связанного с ним окрашенного небелкового компонента. Различают гемопротеины (содержат в качестве простетической группы железо), маг-нийпорфирины и флавопротеины (содержат производные изоаллоксазина). Хромопротеины наделены рядом уникальных биологических функций: они участвуют в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как фотосинтез, дыхание клеток и целостного организма, транспорт кислорода и диоксида углерода, окислительно-восстановительные реакции, свето-и цветовосприятие и др.
Таким образом, хромопротеины играют исключительно важную роль в процессах жизнедеятельности. Например, подавление дыхательной функции гемоглобина путем введения оксида углерода (СО) либо утилизации (потребление) кислорода в тканях путем введения синильной кислоты или ее солей (цианидов), ингибирующих ферментные системы клеточного дыхания, моментально приводит к смерти организма.
Хромопротеины являются непременными и активными участниками аккумулирования энергии, начиная от фиксации солнечной энергии в зеленых растениях и утилизации ее до превращений в организме животных и человека. Хлорофилл (магнийпорфирин) вместе с белком обеспечивает фотосинтетическую активность растений, катализируя расщепление молекулы воды на водород и кислород (поглощением солнечной энергии), Гемопротеины (железопорфирины), напротив, катализируют обратную реакцию- образование молекулы воды, связанное с освобождением энергии.
Гемопротеины
К группе гемопротеинов относятся гемоглобин и его производные, миогло-бин, хлорофилЛсодержащие белки и ферменты (вся цитохромная система, каталаза и пероксидаза). Все они содержат в качестве небелкового компонента структурно сходные железо- (или магний) порфирины, но различные по составу и структуре белки, обеспечивая тем самым разнообразие их биологических функций. Далее более подробно рассмотрено химическое строение гемоглобина, наиболее важного для жизнедеятельности человека и животных соединения.
Гемоглобин в качестве белкового компонента содержит глобин, а небелкового-гем. Видовые различия гемоглобина обусловлены глобином, в то время как гем одинаков у всех видов гемоглобина.
Основу структуры простетнческой группы большинства гемосодержащих белков составляет порфириновое кольцо, являющееся в свою очередь производным тетрапиррольного соединения-порфирина. Последний состоит из четырех замещенных пирролов:

соединенных между собой метановыми мостиками (- -СН=). Незамещенный порфирин называется порфином. В молекуле гема порфин представлен в виде протопорфирина IX, содержащего четыре метальные группы (—СН3), две винильные группы (—СН=СН2) и два остатка пропионовой кислоты. Протопорфирин, присоединяя железо, превращается в гем.

Нуклеопротеины
Нуклеопротеины содержатся во всех клетках животных и растительных организмов, в вирусах. Особенно много их в тканях, богатых ядрами (зобной железе, селезенке, дрожжах и др.). Они нерастворимы в воде, растворяются в щелочах, при слабом подкислении снова осаждаются. В минеральных кислотах, даже очень разбавленных, растворяются легко.
Нуклеопротеины — соединения нуклеиновых кислот и простых белков, связь между белком и нуклеиновой кислотой имеет большей частью электростатическую природу, т. е. кислотные группы нуклеиновых кислот взаимодействуют с аминогруппами белков. Поэтому с нуклеиновыми кислотами соединяются чаще всего белки основного характера (гистоны, протамины). Нуклеиновые кислоты — высокомолекулярные вещества, относящиеся к группе полимеров. Мономерами нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. Каждый нуклеотид состоит из пуринового (аденин, гуанин) или пирим иди нового (цитозин, урацил, тимин) основания, соединенного гликозидной связью с углеводом (чаще всего с рибозой или дезоксирибозой), который в свою очередь образует эфиры с фосфорной кислотой. Примером нуклеотида может служить аденозин-5'-монофосфорная кислота (АМФ), состоящая из аденина, рибозы и фосфорной кислоты.
При гидролизе нуклеопротеины распадаются на свои составные части.

Нуклеиновые кислоты, углеводная часть которых представлена рибозой, называются рибонуклеиновыми кислотами (РНК), а нуклеиновые кислоты, в состав которых входит дезокси рибоза, — дезоксирибонуклеиновыми кислотами (ДНК). В составе РНК отсутствует тимин, ДНК не содержат урацила.
Сахара, содержащиеся в РНК и ДНК, можно идентифицировать с помощью специфических ш реакций: рибоза дает реакции с орцином, а дезоксирибоза — с дифениламином. РНК и ДНК сличаются друг от друга не только по химическому составу, но и по структуре, У всех организмов, за мочением вирусов и бактерий, клеточная ДНК сосредоточивается в основном в ядрах, она является носителем генетической информации. Рибонуклеиновая кислота обнаружена почти во всех клеточных фракциях. Наибольшее ее количество сосредоточено в рибонуклеопротеидных частицах, рибосомах, где происходит биосинтез белков. РНК имеется также в растворимой части цитоплазмы; небольшое количество ее найдено в ядрах и митохондриях.
Нуклеиновые кислоты выполняют в организме ряд важнейших функций: они обеспечивают хранение и передачу генетической информации, участвуют в механизмах, при помощи которых эта Л формация реализуется в процессе синтеза всех клеточных белков. Отдельные нуклеотиды являются небелковой частью ряда окислительно-восстановительных ферментов и носителями макроэргических связей, используемых для энергетического обеспечения многих обменных реакций в организме.

Хромопротеины состоят из простого белка и простетической группы, которая придает определенный цвет всему соединению. В организме многие из них являются катализаторами ряда важнейших окислительно-восстановительных процессов. Представителем хромопротеинов может служить кислород перенося п шп пигмент эритроцитов крови млекопитающих гемоглобин. Белковой частью гемоглобина является белок глобин, а небелковой — гем. Гем представляет собой протопорфирин, пнрроль-ные кольца которого связаны с двухвалентным железом. Связывание кислорода при дыхании происходит через содержащийся в геме атом железа.

В молекуле гемоглобина имеется две пары идентичных полипептидных цепей (обозначаемых как а- и р-цепи), к каждой из цепей присоединен один гем.
При гидролизе гемоглобина в присутствии кислорода (на воздухе) гем освобождается в виде гематина, где железо трехвалентно. У гематин а третья валентность железа связана с гидроксильной группой.
При действии на гемоглобин концентрированной уксусной кислоты в присутствии NaCl из гемоглобина образуются кристаллы гемина. Последний отличается от гема тем, что в нем атом железа окислен до трехвалентного и возникающая таким образом третья валентность атома железа связана с хлором.
Кристаллы гемина окрашены в бурый цвет и имеют характерную форму ромбоидальных пластинок, иногда лежащих крест-на-крест или сложенных в виде звездочек.

Фосфопротеины |Фосфопротеины состоят из простого белка и фосфорной кислоты в качестве простетической группы. Фосфорная кислота соединена с остатками оксиаминокислот (серии, треонин) белковой части по типу сложных эфиров. К фосфопротеинам относится казеин молока, ововителлин яичного желтка и др. Они являются питательным материалом. Вместе с аминокислотами фосфопротеины доставляют необходимую для организма фосфорную кислоту. Фосфорная кислота особенно важна для развития скелета и зубов растущих организмов. Флавопротеины

Флавопротеины содержат прочно связанные с белком простетические группы, представленные изоаллоксазиновыми производными окисленными ФМН и ФАД. Флавопротеины входят в сослав оксидоредуктаз ферментов. катализирующих окислительно-восстановительные реакция в клетке. Некоторые флавопротеины содержат ионы металлов. Типичными представителями флавопротеннов, содержащих также негемовое железо, являются ксантиноксидаза, альдегидоксидаза, СДГ, дигидрооротагдегидрогеназа. ацил-КоА-дегидрогеиаза и транспортирующий электроны флавопротеин На долю двух последних приходится до 80% митохонлриальиых флавопротеинов, выполняющих важную роль в биоэнергетике клетки. Негемовое железо связывается с белковым компонентом, отличающимся от г емсо держащих хромо протеи но в. Железо ко валентно связано с атомом серы остатка цистеина в белке. При кислотном гидролизе такого белка освобождается железо и H2S. Несмотря на структурные отличия от цитохромов, негемовые флавопротеины выполняют аналогичную функцию в транспорте электронов благодаря способности переходить из окисленного в восстановленное состояние.

ЛИПОПРОТЕИНЫ
В последние годы достигнут определенный прогресс в выяснении'химической природы и структуры липо- протеин о в (ЛП). Этот класс сложных белков состоит из белка и простетнческой группы, представленной каким-либо липидом. В частности, в составе липопротеинов открыты нейтральные жиры, свободные жирные кислоты, фосфолигшды, холестериды. Липопротеины широко распространены в природе: в растениях, тканях животных и у микроорганизмов — и выполняют разнообразные биологические функции. Они входят в состав клеточной мембраны и внутриклеточных биомембран ядра, митохондрий, микросом (структурированные липопротеины), а также присутствуют в свободном состоянии (главным образом в плазме крови). К липопрртеинам относятся, кроме того, тромбопластический белок ткани легких, липовителлин желтка куриного яйца, некоторые фосфолипиды молока и т.д. Установлено, что липопротеины участвуют в структурной, комплексной организации миелиновых оболочек, нервной ткани, хлороиластов. фоторецепторной й электронно-транспортной систем, палочек и колбочек сетчатки и др.

Большинство ЛП синтезируется в печени или в слизистой оболочке кишечника. Они содержат гидрофобное липидное ядро, окруженное полярными липидами и оболочкой из белков, получивших название апобелки. Различают 8 типов апобелков: апо-AI, АЦ, В, CI, СИ, СШ, D и Е. Обычно ЛП содержат до 5% углеводов (глюкоза, галактоза, гексозамины, фукоза, сиаловая кислота), поэтому некоторые из них являются и гли копротеинами.
Липопротеины сыворотки крови подразделяют на отдельные классы в зависимости от электрофоретической подвижности (с белками крови) и от плотности при ультрацентрифугировании. Различают ЛП низкой плотности (ЛПНП), очень низкой плотности (ЛПОНП), высокой плотности (ЛПВП), очень высокой плотности (ЛПОВП) и ЛП промежуточной плотности.

МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ
К метадаюротеинам относится биополимеры, содержащие, помимо белиц ионы какого-либо одного металла или нескольких металлов. К таким белкам принадлежат, например, белки, содержащие вегемовое железо, а также белки, координационно связанные с атомами металлов в составе сложных белков-ферментов.
Типичными представителями первых являются железосодержащие белки ферритин. трансферрия и темосидерин. Феррит и и — высокомолекулярный водорастворимый белок с мох массой 400000, в котором содержание железа составляет от 17 до 23% (в среднем 20%). Он сосредоточен главным образом в селезенке, печени, костном мозге, выполняя роль депо железа в организме. Железо в ферритине находится в окисленной форме, в составе неорганического железосодержащего соединения, причем цепи неорганического полимера O—Fe—OH-O—Fe—ОН..., тогда содержащие фосфаты, находятся между пептидными цепями белковой часта (называемая апоферритином), а атомы железа координационно связываются с атомами азота пептидных групп.

Трансферрин -растворимый в воде желеэопротеин (мол. масса 90000). гликопротеин, обнаруживаемый главным образом в сыворотке крови в составе р-глобулинов. Содержание железа в нем составляет 0,13%. Предполагаю!, что атом железа соединяется с белком координационными связями с участием гидроксильных групп тирозина. Молекула трансфер-рина содержит 2 атома железа; трансферрин служит физиологическим переносчиком железа в организме.
Гемосидерин в отличие от ферритина и трансферрина является водонерастворимым железосодержащим белковым комплексом, состоящим, кроме того, на 25% из нуклеотидов и углеводов. Он содержится главным образом в ретикулоэндотелиоцитах печени и селезенки. Биологическая роль гемосидерина изучена недостаточно.
Ко второй группе металлопротеинов относится ряд ферментов: ферменты, содержащие связанные с молекулой белка ионы металлов, определяющих их функцию, -мета л л офер менты (в процессе очистки металлы остаются связанными с i ферментами); ферменты, активируемые ионами металлов, менее прочно связаны с металлами, но для проявления своей активности нуждаются в добавлении в реакционную среду определенного металла. Предполагают, что механизмы участия металла в акте катализа в обоих случаях, вероятнее всего, сходны; ионы металла участвуют в образовании тройного комплекса: активный центр фермента металл-субстрат (Е—М—S), или М—Е—S, или Е—S—М. Есть доказательства, что в активном центре многих ферментов в связывании металла участвует имидазольная группа гистидина.

Гликопротеины
Гликопротеины — это белки, несущие ковалентносвязанные углеводы и их производные, а также нередко остатки серной и уксусной кислот (лишь немногие белки человека лишены углеводов). У некоторых гликопротеинов углеводная часть представлена мукополисахаридами. Они получили название мукопротеинов. Представителями мукопротеинов являются муцины. Они встречаются в секретах слизистых желез. Муцины пищеварительного тракта предохраняют слизистые оболочки от химических, механических, термических воздействий и переваривания протеолитическими ферментами.
При гидролизе белковая часть муцинов распадается на аминокислоты, а простетическая группа — на гексозы, гексозамины, нейраминовые кислоты и другие компоненты. Для анализа удобно пользоваться муцином слюны.

Неэнзиматические макромолекулярные гликопротеины слюны (Мг 0,5—1,0 • 106, на белковую часть приходится ~ 40%, на углеводную ~ 60%) имеют особое значение для вязкости ротовой жидкости и тем самым для скольжения съеденных кусочков пищи. К тому же углеводные части несут анионные группы, которые обусловливают сильную гидратацию. Вязкость слюны в 10— 20 раз больше, чем у плазмы. Различают анионные (Мг 0,5 • 10б, белковая часть ~ 60%, углеводная ~ 40%) и катионные гликопротеины (Mr 4 • 104, белковая часть ~ 60%, углеводная ~ 40%). Последние сецернируются главным образом Gl. parotis. Основной характер возникает от высокой пропорции основных аминокислот (лизин, аргинин, гистидин). Основной характер этих белков придает им свойство покрывать поверхность отрицательно заряженных молекул фосфатов на поверхности твердых тканей зубов. Они составляют существенную часть Cuticula dentis на эмали. Катионные белки претерпевают после связывания на зубе конформационные изменения, уменьшение растворимости в воде и тем самым более прочное прилипание. Плохая растворимость ухудшается, когда бактериальные гликозидазы разрушают углеводные цепи. Вклад в образование Cuticula dentis вносят фосфатсодержашие гликопротеины (~ Мг 6 • 104, белковая часть — 94%, углеводная ~ 5%, фосфаты — 1%). У них, наоборот, кислые фосфатные группы соединяют гликопротеины с кальцием апатитов, несушим по-ложительный заряд.

Реакции осажденных белков
1.Осаждение белков алкалоидными реактивами
Алкалоидные реактивы осаждают как белки, так и алкалоиды — азотистые основания растений. Объясняется это наличием в белке азотистых гетероциклических группировок, аналогичных тем, которые находятся в молекулах алкалоидов (пиррольные, индольные, имидазольные). Осаждение белка алкалоидными реактивами протекает в кислой среде и обусловлено образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотистыми группами белков. При этом происходит адсорбция аниона осадителя, например, [Fe (CN)6]4~ на белковой молекуле, являющейся вследствие под-кисления катионом. Белки, обладающие основным характером (протамины, гистоны), осаждаются алкалоидными реактивами в нейтральной среде.

2.Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами
Белки при взаимодействии с концентрированными минеральными кислотами, кроме ортофос-форной, денатурируются и осаждаются из раствора. Выпадение белка в осадок обусловлено дегидратацией белковых молекул и рядом других причин, например, образованием нерастворимых комплексных солей из белка и кислот и др. Возможно, что в условиях кислой среды, к положительно заряжен-ным коллоидным частицам притягиваются отрицательно заряженные ионы N03" и, адсорбируясь на молекулах белка, экранируют их заряд. В избытке серной и соляной кислот происходит растворение первоначально выпавших осадков белка. Избыток азотной кислоты не растворяет осажденный белок, поэтому для обнаружения белка в исследуемом материале пользуются азотной кислотой.
Реакция с азотной кислотой является высокоспецифичной и высокочувствительной. Она получила широкое применение при клинических исследованиях мочи на присутствие в ней белка (проба I Геллера). Эта реакция лежит в основе количественного определения белка по методу Брандбсрг-Робертс — Стольникова.

3.Осаждение белков органическими кислотами
Реакции с трихлоруксусной (СС13СООН) и сульфосалициловой кислотами являются весьма специфическими и чувствительными (сульфосалициловая кислота открывает белок в разведении 1: 50000). Они получили широкое практическое применение в клинических лабораториях при обнаружении белка в моче и других биологических жидкостях.
Сульфосалициловая кислота осаждает также, помимо белков, продукты их распада — пептоны и высокомолекулярные полипептиды. Трихлоруксусная кис-лота осаждает только белки, а полипептиды и низкомолекулярные азотсодержащие небелковые вещества остаются в растворе. Это свойство трихлоруксусной кислоты используется при определении небелкового (остаточного) азота крови, в состав которого входят продукты распада и обмена белков (полипептиды, аминокислоты, мочевина, мочевая кислота и др.). При этом белки крови осаждают трихлоруксусной кислотой, отделяют фильтрованием, а фильтраты анализируют на содержание в них небелкового азота. Освобождение фильтрата от трихлоруксусной кислоты достигается кипячением; при этом трихлоруксусная кислота разлагается на хлороформ и угольный ангидрид.

4.Осаждение белков фенолом
Осаждением белков фенолом пользуются для удаления их при выделении и очистке нуклеиновых кислот и специфических полисахаридов. На способности фенола денатурировать белки основано его
дезинфицирующее действие.

5.Отделение альбуминов от глобулинов в сыворотке крови методом высаливания сернокислым аммонием и хлористым натрием
Альбумины и глобулины широко распространены в природе. Их различают в зависимости от места нахождения: сывороточные, яичные и т. д. Альбумины и глобулины растворимы в слабых растворах нейтральных солей, щелочей и кислот. Альбумины, в отличие от глобулинов, растворяются в чистой воде. Глобулины (за небольшим исключением) в воде не растворяются, поэтому при разбавлении яичного белка водой, когда концентрация содержащихся в яичном белке солей понижается, глобулины выпадают в осадок и вновь растворяются при добавлении поваренной соли. Одним из методов выделения альбуминов и глобулинов из растворов является высаливание. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация солей, что зависит от ионной силы осадителя и размера белковой молекулы. Так, глобулины выпадают из раствора при полунасыщении (при 50% насыщении) сернокислым аммонием в отличие от альбуминов, которые высаливаются при полном насыщении данной солью. Это связано с тем, что у глобулинов больше молекулярная масса, чем у альбуминов.

При высаливании поваренной солью и сернокислым магнием глобулины осаждаются при полном насыщении этими солями. Альбумины высаливаются при такой же концентрации поваренной соли и сернокислого магния как и глобулины, но в отличие от глобулинов осадок альбуминов выпадает только при подкислении раствора. Подкисление способствует осаждению альбуминов анионами средних солей. При осаждении сернокислым аммонием не требуется подкисления раствора альбуминов кислотой. Отчасти это объясняется тем, что сернокислый аммоний является кислореагирующей солью.
Отделение альбуминов от глобулинов в сыворотке крови имеет диагностическое и прогностическое значение. В норме соотношение между этими двумя фракциями сывороточного белка (А/Г) обычно колеблется в пределах 1,5—2,3. При многих патологических состояниях оно может изменяться. Например, во многих случаях инфекционных заболеваний наблюдается повышение количества глобулинов в плазме крови, и тогда это соотношение (белковый коэффициент) уменьшается.

6.Осаждение белков солями тяжелых металлов
Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (меди, железа, свинца, цинка, серебра, ртути и др.) денатурируются и образуют нерастворимые в воде комплексные соединения, которые выпадают в осадок. Возникновение нерастворимых в воде комплексов обусловлено адсорбцией тяжелого металла на поверхности белковой молекулы. В избытке солей первоначально образовавшиеся осадки растворяются (за исключением солей AgN03 и HgCl2), что связано с адсорбцией тяжелого металла на поверхности коллоидных частиц и появлением положительного заряда на молекуле белка (адсорбционная пептизация). На способности белков образовывать нерастворимые осадки с солями тяжелых металлов основывается использование белков в качестве противоядия при отравлении тяжелыми металлами (ртутные, свинцовые отравления), пока соли этих металлов еще не успели всосаться. При использовании белков (яичный белок, молоко) в качестве противоядий при отравлении следует давать их в больших количествах, учитывая то, что при избытке некоторых солей образуются с белками комплексные растворимые соединения В случае отравления ртутными солями необходимо подождать, что осадок белка, образующийся при воздействии Hg2+, может раствориться в присутствии варенной соли.

7.Осаждение белков органическими растворителями
При добавлении к раствору белка органических растворителей, например, спирта, выпадает осадок белка. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Осаждение наступает только из нейтральных или слабо кислых растворов (в слабо кислой среде заряд на коллоидных частицах белка является наименьшим) и более полно в присутствии электролитов, например, хлористого натрия, что связано с ослаблением внутримолекулярных ионных связей ввиду конкуренции добавленных анионов и катионов. Если осаждение производить при низкой температуре (от 0 до 15е) и полученный осадок быстро отделить от спирта, то белок сохраняет свои природные свойства и может быть вновь растворен в воде. Длительное воздействие спирта приводит к необратимой денатурации белка.
Однако, некоторые белки, например, проламины растений, растворимы в горячем 70—80% спирте, гормон поджелудочной железы — инсулин растворяется в подкисленном 60% спирте. Это зависит от особенностей их первичной структуры.

Вторичная структура нуклеиновых кислот
В соответствии с моделью Дж Уотсона и Ф. Крика, предложенной в 1953 (на основании ряда аналитических данных/ а также ренттеноструктуряого анализа молекула ДНК состоит из двух цепей, образуя правовращаюшую спираль, в которую обе полинуклеотидные цепи закручены вокруг одной и той же оси. Удерживаются цепи благодаря водородным связям, образующимся между их азотистыми основаниями. Обе цепи полинуклеотидов в биспиральной молекуле ДНК имеют строго определенное пространственное расположение, при котором азотистые основания находятся внутри, а фосфорильные и углеводные компоненты снаружи.
Детальный анализ всевозможных вариантов образования водородных связей между основаниями показал, что в биспиральной молекуле ДНК основания уложены парами; пурин из одной цепи и пиримидин из другой в соответствии с правилами Чаргаффа. Поскольку ориентация оснований на плоскости не является, очевидно, произвольной, и основания в полинуклеотидах представлены в лактамной форме, наиболее вероятными были признаны пары аденин тимин и гуанин-цитозин. Этот способ спаривания получил в дальнейшем экспериментальное подтверждение. Избиратель взаимодействия пар A-T и Г- Ц принято выражать термином «комплементарность», а соответствующие азотистые основания называют комплементарными. Стабильность А-Т оснований обеспечивается двумя водородными связями, а пар Г-Ц тремя, что в свою очередь определяется особенностями расположения функциональных групп азотистых оснований. Длина водородных связей между основаниями составляет около 0,3 им. Таким образом, комплементарными оказываются не только отдельные основания, но и дезоксирибонуклеотидные цепи ДНК в целом, способствующие образованию весьма компактной структуры стабилизации всей молекулы.