Определение структуры биологически активных соединений методом флуоресцентной спектроскопии одиночной молекулы

Спектроскопия одиночных молекул (СОМ) — одно из самых современных направлений оптической спектроскопии, включающих методы регистрации спектров (излучения, поглощения), изображений, временной эволюции одиночных молекул в конденсированных средах.

Вообще говоря, люминесценцией называется процесс испускания электромагнитного излучения веществом после того, как вещество поглотило энергию источника света. Люминесценция называется флуоресценцией, если временная задержка между возбуждением и излучением порядка 10 нс. Лазерно-индуцированная флуоресценция может быть использована в большом количестве приложений, включая качественные и количественные измерения концентрации молекул в образцах, и создание диаграмм энергетических уровней[5].

Люминесцентные методы исследования с каждым годом находят все более широкое применение в химии, биологии, медицине, различных областях техники. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью и дают уникальные возможности изучения возбужденных состояний молекул, фотохимических реакций, динамики быстрых молекулярных процессов, структуры и свойств сложных химических и биологических объектов.

Флуоресцентная спектроскопия – весьма чувствительный метод анализа химического состава образца, позволяющий обнаруживать следовые количества веществ и даже их отдельные молекулы. В качестве источников возбуждающего излучения особенно эффективны лазеры.

Упрощенная конструкция флуориметра: свет от источника возбуждения проходит через фильтр или монохроматор и попа образца. Доля падающего света поглощается образцом, и некоторые из молекул в образце начинают флуоресцировать. Флуоресцентный свет излучается во всех направлениях. Некоторые из этих лучей проходят через второй фильтр или монохроматор и достигают детектора, который обычно расположен под углом 90 ° по отношению к падающему световому пучку, чтобы свести к минимуму риск пропущенного или отраженного падающего света, достигающего детектор.

 

Различные источники света могут быть использованы в качестве источников возбуждения, включая лазеры и светодиоды, лампы, ксеноновые дуги и ртутные лампы, в частности. Ртутные лампы – лампы-линии, то есть они излучают свет вблизи пика длин волн. В отличие от ксеноновых дуг ртутные лампы имееют непрерывный спектр излучения с почти постоянной интенсивностью в диапазоне от 300-800 нм и достаточной освещенности для измерения до чуть выше 200 нм.

Изучение флуоресценции обычно производится при помощи перестраиваемых лазеров непрерывного излучения. Только лазер излучает свет высокой освещенности в очень узком интервале длин волн, как правило, до 0,01 нм, что делает монохроматора возбуждения или фильтр ненужной. Недостатком этого способа является то, что длина волны лазера не может быть изменена на много.

Перестраиваемость лазеров на красителях или лазеров на титан-сапфире с удвоением частоты расширяет экспериментальные возможности изучения непрерывной флуоресценции.

Для изучения широкополосной флуоресценции в твердых и жидких образцах обычно удобны ширины линий от 2 до 400 ГГц.

Для изучения флуоресценции в полупроводниках, полимерах и т.п. хорошо подходят такие непрерывные перестраиваемые системы как лазер на красителях со стоячей волной, титан-сапфировый лазер, широкополосный кольцевой лазер.

Для экспериментов по флуоресцентной спектроскопии в газовой фазе наиболее важным параметром является ширина линии. Для надежных исследований с высоким разрешением, которые требуют ширины линии меньше 10 МГц при высокой выходной мощности, разработаны кольцевые лазеры, работающие на красителях и титан-сапфире.

Важным вкладом в развитие флуоресцентной спектроскопии явилась разработка ультрабыстрых лазеров, способных генерировать пикосекундные и фемтосекундные импульсы для флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Такие лазеры позволили производить возбуждение вещества за время, много меньшее времени жизни возбужденного состояния[6].

Метод количественного определения веществ по интенсивности линий молекулярной флуоресценции. Спектр флуоресценции молекулы находится в области более длинных волн по сравнению с её же спектром возбуждения (см. рисунок).

Для разбавленных растворов зависимость между интенсивностью флуоресценции и концентрацией приближенно выражается формулой

Где Q - квантовый выход флуоресценции; I₀ - интенсивность возбуждающего излучения, ε - молярный коэффициент поглощения на; с - концентрация определяемого вещества.

По сравнению с абсорбционной спектроскопией флуоресцентный метод характеризуется более широким диапазонами определяемых концентраций (от 10-7 до 10-4 М/литр) [7].

Применение

Применяется для непосредственного определения органических веществ, обладающих собственной флуоресценцией, а также для анализа биологических молекул и клеточных культур с помощью флуоресцентных зондов (меток).

Основные биомедицинские приложения флуоресцентной спектроскопии – определение фрагментов ДНК, полученных в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализ клеточных культур, иммуно-флуоресцентный анализ, некоторые виды биохимических анализов.
Для измерения флуоресценции и абсорбции биологических и медицинских проб очень эффективны микропланшетные оптические анализаторы, позволяющие в 10 и более раз повысить производительность анализа и значительно уменьшить расход пробы, по сравнению с кюветными приборами [7].

- Флуоресцентная спектроскопия используется, в частности, для биохимических, медицинских и химических исследований органических соединений.

- Атомная флуоресцентная спектроскопия (AFS) может быть использована при анализе / измерении соединения, присутствующего в воздухе или воде, или на других носителях (например, CVAFS - используется для обнаружения тяжелых металлов, таких как ртуть).

- Флуоресценция может также использоваться для перенаправления фотонов.

- Кроме того, флуоресцентная спектроскопия может быть адаптирована к микроскопическим уровням с использованием микрофлуориметрии

- В аналитической химии, флуоресцентные детекторы используются с ВЭЖХ.

- Также метод флуоресцентной спектроскопии широко распространен в медицине, для отличия злокачественных опухолей от доброкачественных, при дифференциальной диагностике хирургических заболеваний легких[8].

Более подробную информацию о данном методе можно найти в книгах:

· Н.Л. Векшин. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров. Краткий учебный курс. Пущино: Фотон-век, 2008, 168 с.

Книга доктора биологических наук, ведущего научного сотрудника Института биофизики клетки Российской Академии наук Н.Л. Векшина представляет собой краткий учебный курс по флуоресцентной спектроскопии биополимеров и их комплексов. Даются общие сведения по спектроскопии, техника эксперимента и биологические примеры. В качестве примеров приводятся белки, ДНК, олигонуклеотиды, коферменты, антибиотики, флуоресцентные зонды, красители, фермент-субстратные комплексы, биомембраны и т.п. (в основном – из собственного опыта автора). Книга предназначена для студентов ВУЗов и аспирантов, обучающихся по специальности «биофизика», а также может быть полезна биохимикам, физ-химикам и другим исследователям, заинтересованным в использовании флуоресцентных методов.

· Дж. Лакович. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986,с.488.
Книга известного специалиста из США в области применения люминесцентных методов в биологии и медицине представляет собой пособие для изучения основ флуоресцентной спектроскопии и ее приложений как для начинающих работать в этой области, так и для специалистов, желающих более детально ознакомиться с возможностями современных флуоресцентных методов. Книга предназначена для химиков, биологов, технологов, медиков - научных работников, преподавателей и студентов высших учебных заведений.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Гичев Ю. Ю., Гичев Ю. П. Руководство по микронутриентологии. Роль и значение биологически активных добавок к пище. — М.: «Триада-Х», 2006. — С. 20—25

2. Громова Н. Ю., Косивцов Ю. Ю., Сульман Э. М. Технология синтеза и биосинтеза биологически активных веществ: Учебное пособие. — Тверь: ТГТУ, 2006. — 84 с

3. Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия. — 3. — Москва: Высшая школа, 2000. — 479 с.

4. Тиноко И., и др.Физическая химия. Принципы и применение в биологических науках: пер. с англ. / – М.: Техносфера, 2005. – 744 с.

5. http://www.physicexperts.ru/pexps-669-1.html

6. http://optics.alt.ua/optics/catalog/analittask.php?IBLOCK_ID=94&SECTION_ID=0&ELEMENT_ID=31073 – Лабораторное оборудование

7. http://www.cortec.ru/index.php?id=37

8. http://medical-diss.com/medicina/differentsialnaya-diagnostika-hirurgicheskih-zabolevaniy-legkih-s-pomoschyu-fluorestsentnoy-spektroskopii#ixzz2kYpkIiAI - Рыбин В.К. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук