ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. По медицинской биологии и генетике

ЛЕКЦИЯ № 3

По медицинской биологии и генетике

Для студентов 1 курса лечебного факультета

Тема: «Организация наследственного материала (II).

Экспрессия генов у про- и эукариот».

Время - 90 мин.

Учебные и воспитательные цели:

1. Дать понятия основной генетической терминологии.

2. Объяснить особенности строения гена у про- и эукариот.

3. Разобрать принципы экспрессии генов.

4. Ознакомить с целями и задачами генной инженерии.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Бекиш О.-Я.Л. Медицинская биология. Курс лекций для студентов мед. ВУЗов. - Витебск, 2000 с. 101-119.

2. Биология / Под ред. В.Н. Ярыгина / 1-я книга - М.:Вш,1997. с. 99-113, 174-180.

3. О.-Я.Л. Бекиш, Л.А. Храмцова. Практикум по мед.биологии. - Изд. «Белый Ветер», 2000 - с. 49-52.

4. Заяц Р.Г., Рачковская И.В. Основы общей и медицинской генетики. Мн.: ВШ, 1998. - с.53-65.

5. Бочков И.П., Захаров А.Ф., Иванов В.И. «Медицинская генетика». - М.: Медицина, 1984. - с. 50-55.

6. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека: в 3-х т., т. 2-й - М.: Мир, 1990. - с.130-132.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

1. Мультимедийная презентация.

РАСЧЕТ УЧЕБНОГО ВРЕМЕНИ

№ п/п	Содержание	Расчет рабочего времени
1.	Общее понятие генетического материала и его свойства.
2.	Строение гена у про- и эукариот.
3.	Механизмы генной регуляции у прокариот.
4.	Экспрессия генов эукариот. Гемоглобины человека.
5.	Генная инженерия.
6.	СРС.
Всего:

Вопрос 1

В начале 50-х годов 20 века было доказано, что материальной единицей наследственности и изменчивости является ген, который имеет определенную структурно-функциональную организацию. По современному определению ген - это участок молекулы ДНК, детерминирующей синтез определенного полипептида.

С открытием явлений трансформации и трансдукции и конъюгации у микроорганизмов, была доказана роль ДНК в передаче наследственной информации.

Половой процесс у бактерий, при котором осуществляется перенос генетической информации, называется конъюгацией.

Трансформация - это способность одного штамма бактерий встраивать участки молекулы ДНК другого штамма и приобретать при этом свойства последнего (опыты Ф. Гриффита с вирулентными и невирулентными штаммами пневмококков).

Трансдукция - это способность бактериофагов переносить фрагменты ДНК от одного штамма бактерий к другому и передавать соответствующие свойства.

Генетический материал - компоненты клетки, структурно- функциональное единство которых обеспечивает хранение, реализацию и передачу наследственной информации при вегетативном и половом размножении. Генетический материал обладает универсальными свойствами живого: дискретностью, непрерывностью, линейностью, относительной стабильностью.

Основными свойствами генетического материала являются:

1) Ген хранит и передает информацию.

2) Ген способен к изменению генетической информации (мутации).

3) Ген способен к репарации и ее передаче от поколения к поколению (процесс восстановления природной структуры ДНК, поврежденной при нормальном биосинтезе ДНК в клетке химическими или физическими агентами).

4) Ген способен к реализации - синтезу белка, кодируемого геном при участии двух матричных процессов: транскрипции и трансляции.

5) Генетический материал обладает устойчивостью. Устойчивость генетического материала обеспечивается: - диплоидным набором хромосом; - двойной спиралью ДНК; - вырожденностью генетического кода; - повтором некоторых генов; - репарацией нарушенной структуры ДНК.

Вопрос 2

Первоначально предполагалось, что ген является неделимой, целостной единицей. В целом ген подвергается мутациям, рекомбинациям и отвечает за функцию. Однако оказалось, что ген дискретен.

Наиболее четко дискретность гена была изучена американским генетиком С. Бензером на примере исследований тонкой структуры генов фага Т4 кишечной палочки. Им было показано, что ген может быть разделен кроссинговером на множество частей. Дискретная организация генов была установлена и у эукариот.

В конце 50-х годов Бензер предполагал, что ген одновременно является целостной и дискретной единицей. При выполнении основной функции - программировании синтеза белка - ген выступает как целостная единица, изменение которой вызывает изменение структуры белковой молекулы. Эту единицу Бензер назвал цистроном. По величине он примерно равен гену.

Дискретность гена заключается в наличии субъединиц. Элементарная единица изменчивости, единица мутации названа мутоном, а единица рекомбинации - реконом. Минимальные размеры мутона и рекона равны 1 паре нуклеотидов и называются сайт. Таким образом, сайт - это структурная единица гена. Кодон – функциональная единица гена.

Размеры генов различны. Число пар нуклеотидов в структурном гене, по-видимому, составляет около тысячи. Самые короткие известные структурные гены - гены транспортных РНК - содержат более 190 нуклеотидных пар, а самые крупные (например, ген фибрина шелка тутового шелкопряда) достигает размера более 16 тысяч пар нуклеотидов.

Вплоть до конца 70-х годов полагали, что гены существуют в виде целого отрезка ДНК. Однако в 1977 г. было показано, что у аденовируса некоторые гены существуют не в виде целого отрезка ДНК, а в виде фрагментов, распределенных вдоль генома.

Последовательность нуклеотидов, составляющая мозаичный ген, вначале переписывается в молекулу про- и РНК, которая является своего рода предшественником и-РНК

Участки, несущие информацию, названы экзонами, а не выражающие ее - интронами. Например, ген цепи - глобулина человека включает в себя три экзона и два интрона: ген постоянного участка тяжелой цепи иммуноглобулинов мыши содержит 4 экзона и 4 интрона.

Затем про- и РНК подвергается поэтапному сплайсингу и только после этого получается и-РНК, готовая для последующей транскрипции. Объяснение факта существования интронов пока не найдено. Допускается, что в момент образования и-РНК из про- и РНК может иметь место различное сцепление экзонов друг с другом, что приведет к синтезу различных белков. Возможно, интроны служат материалом для образования новых генов в процессе эволюции. Показано, что мутация интронов могут нарушать процесс сплайсинга, останавливать синтез белка и изменять его структуру.

Вопрос 3

Генетические механизмы экспрессии генов были изучены у микроорганизмов французскими генетиками Ф. Жакобом и Ж. Моно.

Главное положение этой теории состоит в том, что в ДНК имеются следующие типы генов:

1) структурные - последовательность их нуклеотидов кодирует структуру синтезируемых клеткой макромолекул (полипептидов, белков, р-РНК, т-РНК);

2) функциональные или акцепторные - последовательность их нуклеотидов не имеет кодирующей функции, но с помощью присоединения к ним разных белковых факторов управляют работой структурных генов. К ним относят: регуляторы, операторы, модификаторы.

3) Транспозоны – это мобильные генетические элементы (мобильные ДНК, подвижные гены).

Мобильные генетические элементы – это мобильные последовательности ДНК, найденные в геномах всех организмов. Во многих геномах они находятся в изобилии: например, они составляют до 50% человеческой ДНК. Большинство транспозонов способны встраиваться в различные участки ДНК, основываясь на механизмах, которые отличны от рекомбинации гомологичных хромосом. Они часто вызывают мутации, либо вставляясь в другой ген и разрушая это, или вызывая перестройки ДНК, такие как делеции, дупликации и инверсии.

Мобильные элементыбывают автономными и неавтономными. Среди автономных, одни имеют только те последовательности, которые необходимы для их собственного перемещения, тогда как другие имеют сложную структуру и кодируют ряд функций, не связанных непосредственно с перемещением. Неавтономные транспозоны для транспозиции нуждаются в ферментах, кодируемых автономными транспозонами.

У человека транспозоны были обнаружены в 1991, когда Фрэнсис Коллинз и его коллеги обнаружили 31-летнего человека с нейрофиброматозом, вызванным перемещением последовательности Alu. Нейрофиброматоз - болезнь, которая вызывает многочисленные опухоли кожи и нервов. В настоящее время установлено, что от 45 до 50% (по данным разных авторов) человеческого генома состоят из последовательностей, происходящих от мобильных элементов, хотя большинство этих элементов является бездействующими и не способны к перемещению. Из них, около 2% - это ДНК транспозоны и приблизительно 42% - ретротраспозоны.

Эволюционное значение мобильных генетических элементов неизвестно, но были предложены три гипотезы объясняющих их происхождение. Гипотезы «клеточной функции» предполагает, что мобильные элементы обеспечивают какую-то важную функцию клетки. Гипотеза «генетической изменчивости» предполагает, что мобильные элементы, вызывая мутации, обеспечивают эволюционную гибкость видов. Гипотеза «эгоистичной ДНК» предполагает, что мобильные элементы не приносят какую-либо пользу клетки, но они широко распространены из-за того, что они могут копироваться и распространяться.

Один или несколько структурных генов, расположенных в бактериальной или вирусной «хромосоме» рядом с группой регуляторных генов, представляют вместе единицу генетической регуляции - оперон.

Принципы работы оперона прокариот рассмотрим на примере работы оперона кишечной палочки, ответственного за усвоение лактозы этой бактерии.

Лактозный оперон

регулятор

Сар-белок

промотор

оператор

Нуклеоид бактериальной клеточной палочки включает различные участки, в том числе и лактозную область (lac оперон). Последняя область включает 3 гена, кодирующие 3 фермента: β - галактозидазу, пермеазу, трансацетилазу (z, у, ас). β - галактозидаза расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу; пермеаза - способствует проникновению лактозы в клетку. Все гены lak оперона транскрибируются в одну и-РНК, которая транслируется с образованием 3-х белков.

Оперон начинается с участка, к которому присоединяется особый белок-активатор - Сар-белок, активизирующий катаболические гены. Без этого белка фермент РНК-полимераза не может связаться с опероном и начать транскрипцию. Сар-белок предварительно активизируется сам присутствующим в клетке циклическим аденозинмонофосфатом (ц АМФ). Вслед за этим участком лежит просмотр. Это последовательность нуклеотидных пар, опознаваемая РНК-полимераза, которая прикрепляется к промотору и затем продвигается вдоль оперона, транскрибируя его. За промотором находится оператор, состоящий из 21 пары нуклеотидов, который играет важную роль в регуляции работы оперона, так как с ним может связываться особый тормозящий транскрипцию белковый фактор – регуляторный белок. Заканчивается lak - оперон терминатором - небольшим участком ДНК, служащим стоп-сигналом, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипцию оперона.

Основная регуляция работы структурных генов lak - оперона осуществляется регуляторным белком, который кодируется геном-регулятором. Этот белок синтезируется непрерывно, но в очень небольшом количестве в клетке (одновременно в цитоплазме присутствует не более 10 его молекул). Регуляторный белок обладает сродством с оператором lak-оперон и если в питательной среде нет лактозы, то прикрепляется к оператору и препятствует продвижению РНК-полимеразы от промотора к структурным генам, которые оказываются репрессированными. Синтез кодируемых ферментов не идет. При поступлении в питательную среду лактозы регуляторный белок связывается с лактозой раньше, чем его молекулы достигнут оператора и сильно изменяет свою структуру, вследствие чего теряет способность присоединяться к оператору. Лактоза выполняет роль эффектора -низкомолекулярного вещества, изменяющего свойства белка при соединении с ним. Измененный регуляторный белок перестает связываться с оператором, РНК - полимераза свободно продвигается по оперону, транскрибирует структурные гены и в клетке начинается синтез всех трех ферментов, необходимых для усвоения лактозы, т.е. происходит индукция (экспрессия гена).

Регуляция активности генов у эукариот изучена менее полно, чем у вирусов и прокариот, что обусловлено наличием у них ядра, сложно устроенных хромосом и дифференицацией клеток. Допускается, что в основе регуляции действия генов у эукариот лежат механизмы, в принципе сходные с таковыми у вирусов и прокариот. Однако, есть и существенные отличия.

1) Почти всегда оперон эукариот содержит только один структурный ген в то время как у вирусов и прокариот в большинстве оперонов их бывает несколько, иногда более десятка.

2) У эукариот структурные гены, ответственные за разные звенья той или иной цепи биохимических реакций, как правило, разбросаны по геному, а не сосредоточены в одном опероне, как это часто имеет место у прокариотов.

3) У эукариот существует одновременное групповое подавление активности генов во всем ядре, в целой хромосоме, или в большом ее участке. Такая групповая репрессия генов осуществляется в значительной мере гистонами-белками, входящими в состав эукариотических хромосом. Примером групповой регуляции активности генов - это полное прекращение транскрипции всех генов при сперматогенезе.

4) Существует система регуляции с помощью стероидных гормонов. Последние связываются со специальными белками - рецепторами, расположенными в мембранах клеток - мишеней. Синтез белков - рецепторов контролируется геном тестикулярной феминизации Х - хромосомы. Такой комплекс обеспечивает активацию определенного гена.

5) Транскрипция и трансляция у эукариот разобщены (у прокариот - сопряжены). Синтез и-РНК происходит в ядре, а белков - на рибосоме. Без гормонального сигнала, которые и-РНК остаются не транслированными.

Примером сложной экспрессии генов может служить генный контроль синтеза гемоглобинов у человека. Известно, что гемоглобин является сложным белком четвертичной структуры. Он состоит из четырех полипептидных цепей. Каждая цепь контролируется определенным генным локусом.

Вид Hb	Полипептидные цепи	Генные локусы
HbА HbА₂ HbF Hbs	2α, 2β 2α, 2σ 2α, 2γ 2α, β, β^6-^вал	α^А, β^А α^А, σ^А² α^А, γ^F α^А, β^А'

НвА и НвА2 относятся к нормальным гемоглобинам человека. В эритроцитах плода около 80% гемоглобина падает на форму НвF, его молекула состоит из двух цепей α и двух цепей γ. У больных серповидноклеточной анемией имеется особый гемоглобин НВS, который отличается от нормального НвА тем, что у него в одной β цепи в 6-ом положении глутаминовая кислота заменена валином (а в гемоглобине НвC-лизином).

Четыре типа гемоглобинов контролируются отдельными генами:

- локус α^А определяет формирование α цепей в течение всей жизни у всех четырех гемоглобинов;

- локус β^А контролирует формирование β цепей только в НвА после рождения;

- локус γ^F определяет синтез γ цепи в гемоглобине НвF в течение внутриутробной жизни;

- локус σ^А2 определяет синтез σ цепей в гемоглобине НвА₂ в течение всей жизни после рождения.

Локусы α^А, β^А, σ^А2, γ^F тесно сцеплены в хромосоме. Все четыре указанных генов - структурные. В их действии имеется сложная экспрессия, благодаря чему возникают четыре типа гемоглобинов.

Экспрессия генов β^А, σ^А2 находится под влиянием генов-регуляторов. У взрослого человека происходит замена НвF плода на НвА, НвА2.

При этом происходит репрессия гена γ^F и включение гена β^А. Взаимодействие генов α^А, β^А, σ^А2 определяет развитие нормального гемоглобина и является примером межгенного взаимодействия.

При формировании гемоглобина серповидноклеточной анемии наблюдается межаллельное взаимодействие аллели β^А и ее патологической аллели.

Вышеизложенные данные позволили сформулировать современную теорию гена, которая утверждает:

1. Ген занимает определенный локус в хромосоме.

2. Ген (цистрон) - часть молекулы ДНК; число нуклеотидов в гене неодинаково.

3. Внутри гена может происходить рекомбинация и мутация.

4. Существуют структурные и функциональные гены.

5. Структурные гены контролируют синтез полипептидов (аминокислотных, т-РНК, р-РНК) и белков.

6. Функциональные гены контролируют деятельность структурных генов.

7. Расположение триплетов в генах структурных колинеарной последовательности аминокислот в полипептиде.

8. Генотип, будучи дискретным, функционирует как единое целое.

Многие годы биологи рассматривали гены как статические элементы ДНК, которые занимают определенные положения на хромосомах. Но теперь признается, что многие генетические структуры не занимают четко установленных положений. Генам, которые могут перемещаться, дали множество названий, таких как: транспозоны,мобильные генетические элементы, мобильная ДНК, подвижные гены и «прыгающие» гены.

Вопрос 4

Одним из разделов молекулярной генетики и молекулярной биологии, который приблизился к рубежу практических приложений является генная инженерия. Генная инженерия - это сумма методов, позволяющая переносить гены из одного организма в другой, или - это технология направленного конструирования новых биологических объектов (С.И. Алиханян, 1980г.). К генной инженерии принято относить следующие операции:

1) Синтез генов вне организма.

2) Выделение из клеток отдельных генов или генетических структур (фрагментов хромосом, целых хромосом, ядер).

3) Направленную перестройку выделенных структур.

4) Копирование и размножение выделенных генов или синтезированных генов или генетических структур.

5) Перенос и включение таких генов или генетических структур в подлежащий изменению геном.

6) Экспериментальное соединение геномов в одной клетке.

1. Получение генетического материала.

Осуществляется путем его выделения из генома клеток донора, либо путем его синтеза химическим путем или с помощью и-РНК и фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Нужный ген получают путем вырезания его из ДНК с помощью особых ферментов лигазами. Такой способ был разработан на плазмидной ДНК бактерий.

2. Введение генетического материала.

Осуществляется путем трансформации, трансдукции, конъюгации и соматической гибридизации.

Трансформация - способ рекомбинации генов не половым путем за счет переноса и включения фрагментов ДНК от донора к реципиенту (встраивание ДНК одной бактерии в ДНК другой).

Трансдукция – перенос ДНК с помощью фага.

Конъюгация – способ передачи генетической информации у бактерий при контакте.

Гибридизация соматических клеток приводит к слиянию двух протопластов клеток и образованию ядра с диплоидным набором хромосом. Затем гибридная клетка делится, и образуются дочерние гибридные клетки с признаками обоих родителей.

3. Включение новых генов в генетический аппарат клеток.

Новые введенные гены не способны к самостоятельному воспроизведению. Поэтому они вначале вводятся в состав структуры, способной к воспроизведению. Она называется вектором. Это молекула ДНК, которая способна переносить в клетку чужой ген и обеспечивать его размножение там. Векторами могут быть плазмиды бактерий, бактериофаги, вирусы животных, космиды – фрагменты бактериофагов с плазмидами.

С помощью генной инженерии решено ряд проблем биологии: мозаичное строение гена, расшифровка структуры гена, кодирующих иммуноглобулины. В 1980г - получен гормон соматотропин, в 1982 инсулин методом генной инженерии, а также интерферон, витамины, и другие гормоны. Генная инженерия является основой биотехнологии, а в медицине обеспечивает производство вакцин, сывороток, а также диагностику генетических аномалий человека на ранних стадиях развития (генная хирургия - замена поврежденного гена новым), генная терапия клонирования организмов.

В 2001 году усилиями генетиков программы «Геном человека» открыто количество генов, составляющих 31 тыс. генов в геноме человека. Это расширяет возможности использования генетики для медицинских целей.

Однако выращивание гибридов человека и химер, а также все работы по клонированию человека, по мнению большинства ученых-генетиков должны быть запрещены.

Пересадка генов должна проводиться для человека только в терапевтических целях, с помощью соматических клеток. Применение половых клеток для генного лечения возможна только при достаточном доказательстве безопасности такого лечения по сравнению с генной терапией соматическими клетками.

ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Лаборантскому составу по материально-техническому обеспечению лекции:

1. Обеспечить мультимедийную презентацию.

Зав. кафедрой,

доцент Л.П. Гаврилова

«___» ___________________ 20__ г.