Откуда название «аргонавт»?

При нокауте МАLAT к-во paraspeckles уменьшается

Однако некоторые ядерные структуры самоорганизуются из белков без участия некодирующих РНК.

МРНК в дифференцированной клетке может задерживаться в ядре. Желтые нити, из которых состоит шарик – NEAT РНК. Параспеклов нет в эмбриональных стволовых клетках, мРНК не удерживается в ядре, транслируется в цитоплазме. Полученные белки препятствуют дифференцировке клеток и обеспечивают плюрипотентность.

И последнее о роли нкРНК в регуляции ядерно-цитоплазматических отношений.

Некодирующая РНК NRON – n on coding r epressor o f N FAT (N FAT – транскрипционный фактор NF of activated Т cells, попадает в ядро по сигналу – фосфорилированию). Мишень NFAT – ген теломеразы. ncNRON препятствует входу в ядро (с участием импортина) транскр.фактора NFAT, каким образом – не сказал(((.

Итог о роли РНК в регуляции транскрипционной генетической программы

• Связывание с факторами транскрипции, аллостерические эффекты за счет изменения конформации белка

• Реализация гормональных эффектов - нкРНК, определяющая функционирование стероидных гормонов.

• Enhancers nc eRNAs – благодаря тому, что энхансеры транскрибируются, они узнают свою мишень, без транскрипции, возможно, они не узнают ее

• Регуляция элонгации транскрипции (7SK)

• Регуляция процессинга РНК и сплайсинга – спеклы и параспеклы

• Транспорт из ядра в цитоплазму

• Структурная роль в сохранении транскрипта в ядре

Короткие 20-35 н регуляторные РНК

1.siРНК, small interfering (RNA interference)

2. микро РНК

3. piРНК, связываемые белками cемейства Piwi (самый обильный класс коротких РНК).

РНК-интерференция РНКи

Исследования начались в начале 20 века. 2006 год – Нобелевская премия.

В широком смысле – способ регуляции экспрессии генов (чаще сайленсинг) с участием короткой РНК (30-20 нуклеотидов) (хотя недавно открытые piРНК больше 30 нт) и эффекторных белков (Аргонавт), участвующих в узнавании комплементарных последовательностей в составе комплекса «короткая РНК - РНК-мишень», а возможно и РНК-ДНК.

РНК-интерференция участвует в подавлении трансляции, обеспечивает образование гетерохроматина, участвует в перестройке генома.

Была обнаружена в 1998 году. Изучали экспрессию генов у C.elegans, пытались подавить экспрессию генов путем введения antisense РНК (до этого были высказаны теоретические предпосылки). Однако самый лучший эффект (подавление мишени) был достигнут при введении двунитевой РНК. Вывод – контроли – очень важная часть эксперимента. Подавление мишени специфично!

У дрозофилы биохимически обнаружили Dicer – эндонуклеазу (РНКаза III типа), осуществляющую расщепление dsРНК на кусочки siРНК длиной 20-30 нуклеотидов с 3’OH – выступающими динуклеотидными концами. Это этап инициации функционирования РНК-интерференции.

Далее кусочки входят в состав комплекса белков RISC (RNA Induced Silencing Complex), главный из которых белок Аргонавт. Argonaute выбирает одну из нитей, для узнавания мишени. Белки-аргонавты могут обладать эндонуклеазной активностью или просто взаимодействовать и подавлять транскрипцию.

В 1998 году была открыта интерференция с помощью экзогенной siРНК, теперь известно, что в клетке есть эндогенная siРНК, принимающая участие в регуляции экспрессии генов.

Откуда название «аргонавт»?

1998 год – опубликована работа на арабидопсисе. Выявлен ген, отвечающий за дифференцировку клеток меристемы. Фенотип мутанта: нарушается дифференцировка листьев. Листья напоминают щупальца моллюсков семейства Аргонавт.

У нематоды этих белков особенно много, они выполняют разнообразные функции.

Белки очень консервативны. У человека их 4.

РНКи как метод исследования

- способ выяснения функции нкРНК

- терапевтический агент (сложна проблема доставки siРНК в нужные органы, хотя сначала был бум исследований)

Современный способ исследования Knock down (в отличие от knockout) – способ сильно снизить образование белка с целью выяснения его биологической функции можно осуществлять с помощью РНКи. Особенно хорошо действует для уничтожения РНК в цитоплазме, в ядре очень плохо, либо вообще не идет.

Эндогенные siРНК осуществляют защиту генома от транспозонов и вирусов, регуляция экспрессии собственного генома. А экзогенные участвуют в борьбе против инфекционных агентов.

Дайсер – эндонуклеаза, относится к семейству РНКаз III, осуществляющих процессинг рРНК.

Красные и синие – отрицательно и положительно заряженные аминокислотные участки соответственно. Имеет 2 эндонуклеазных домена, которые в составе молекулы димеризуются. 3’-конец дцРНК узнается одним доменом (возможно, PAZ), дальше он кладет РНК на свое тело (жуткая словарная конструкция). После первого разрезания Dicer отмеряет от 3’OH-конца определенное расстояние и вносит разрыв – поэтому молекулярная линейка. Фосфаты участвуют в электростатических взаимодействиях с + аминокислотами.

 

Дайсер никогда не работает один, имеет возле себя биохимическую нишу – дополнительные белки-партнеры.

У человека, нематоды, млекопитающих один Дайсер. У растений их несколько, у дрозофилы два. И Дайсер, и его партнер имеют RNA-binding domain, узнающий дцРНК. Участвуют в узнавании концов. А-У слева термодинамически менее устойчива, чем Г-Ц справа, поэтому только нижняя красная нить попадает в зрелый комплекс, становится РНК-гидом, так как у нее менее стабильный 5’-конец. Если стабильность одинаковая, происходит случайное включение.

 

Белки Аргонавт имеют сходную структуру у разных организмов.

Белок Аргонавт тоже имеет PAZ-домен, которые узнает 3’OH-конец РНК-гида, 5’-конец узнается другим доменом и вступает в стэкинг-взаимодействие с ароматической АК (например, с Tyr) → зрелый комплекс.

4 домена NTD, PAZ, PIWI-домен, обладающий эндонуклеазной активностью, MID – средний.

2 доли, между ними активный центр. Каталитический сайт представлен Asp, Asp, Asp/Glu (каталитическая триада) + 2 Mg²⁺, хотя не всегда Аргонавт с триадой будет работать как эндонуклеаза. Каталитический центр похож на каталитический центр РНКазы Н. У человека 4 Аргонавта, все имеют триаду, но только один активен – очевидно, каталитическую активность определяют еще конформационные переходы.

Картинка – PAZ в Дайсере и Аргонавте

Аргонавты были исследованы даже у термофилов-прокариот, их белки имеют меньшую подвижность – удобно проводить РСА. Что тут делает Аргонавт – неизвестно, т.к. у бактерий нет системы siРНК. У бактерий Аргонавты гораздо лучше связывают ДНК, чем РНК.

Выяснилось, что AGO могут выполнять и функции, которые не связаны с узнаванием РНК. Оказалось, что один из Аргонавтов участвует в образовании инсуляторного комплекса.