М. tuberculosis сәйкестендіруідің негізгі биохимиялық тесттері

10. Өсіп шыққан микобактериялардың М. tuberculosis кешеніне жататынын арнайы зертханалық тесттер негізінде міндетті түрде дәлелдеу қажет.
11. М. tuberculosis кешені микобактерияларын туберкулезді емес микобактериялардан бастапқы идентификациялау келесі культуральдық белгілер бойынша жүргізіледі: қатты қоректік орталарда өсу жылдамдығы; пигмент түзу; колониялардың морфологиясы; қышқылға төзімділіктің болуы; өсу температурасы. М. tuberculosis кешеніне микобактериялардың келесі түрлері жатады: М. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. Microti. Оларды баяу өсетін қышқылға төзімді туберкулезді емес микобактериялардын ажырату үшін келесі негізгі биохимиялық тесттер қолданылады: никотин қышқылын бөлу мүмкіндігін анықтайтын тест (ниацинды тест); нитратредуктазды белсенділіктің болуын анықтайтын тест; термотұрақты каталазаның болуын анықтайтын тест; салицил қышқылды натрийі (1 мг/мл) бар ортада өсу тестті (немесе паранитробензой қышқылының 500 мкг/мл мөлшері бар ортада өсу тестті; 5% натрий хлориді бар ортада өсу тестті).
12. М. tuberculosis және М. bovis ажырату үшін келесі сынамалардың нәтижелері есепке алынады: ниацинды тест; нитратредуктазаның бар болуын анықтайтын тест; пиразинамидазаның бар болуын анықтайтын тест; молекулалы-генетикалық зерттеумен түрін анықтау (Geno Type MTB® DR).

ТМБ ТҚП сезімталдық тестін қатты қоректік орталарда анықтау

13. ТМБ туберкулезге қарсы қолданылатын бірінші және екінші қатардағы дәрілерге сезімталдығын Левенштейн-Йенсен (бұдан әрі – Л-Й) қоректік ортасында пропорция әдісімен анықтайды.
14. ДСТ пропорция әдісімен анықтау үшін Л-Й ортасы қолданылады, тест жүргізіліп отырған штаммдардың төзімділігі дәрілері бар ортада өсіп шыққан колониялар санының дәрілері жоқ ортада өсіп шыққан колониялар санына қатынасы ретінде есептеледі. Бұл көрсеткіш тіршілікке қабілетті колония түзетін бірліктердердің (бұдан әрі - КТБ) жалпы популяциясындағы төзімді мутанттар пайызын анықтауға мүмкіндік береді.
15. ДСТ қатты қоректік ортада пропорция әдісімен бекітілген стандарттарға сәйкес жасалады.
16. Л-Й ортасындағы дәрілік заттардың сыни концентрациялары:
Изониазид - 0,2 мкг/мл; Стрептомицин - 4,0 мкг/мл; Рифампицин - 40 мкг/мл; Этамбутол - 2,0 мкг/мл; Офлоксацин - 2 мкг/мл; Амикацин - 20 мкг/мл; Капреомицин - 20мкг/мл; Этионамид - 20 мкг/мл; Циклосерин - 20 мкг/мл; ПАСК - 1,0 мкг/мл; Канамицин - 20 мкг/мл.
17. Дәрілері бар қоректік ортаны дайындау барысында өндірушіге сәйкес дәрілердің бір партиясынан/сериясынан келесісіне өзгеріп отыруы мүмкін дәрілердің белсендігін ескеру қажет. Бұл мәліметтер контейнерлердің сыртындағы заттаңбада, орауышында жазылуы мүмкін немесе өндірушінің өзі хабардар етеді.
18. Түтіктерді термостатта еңкейтіп, қақпағын тығыздап жаппай, 37⁰ C температурада дәрісіз қоректік ортада көзге көрінетін өсінді пайда болғанға дейін, содан кейін 4-6 апта бойы ауызын бітеп сақтайды.
19. Нәтижесін бағалау. Төзімділіктің болуына нұсқайтын белгі – барлық дәрілер үшін бактериальды популяцияның 1,0% өсуі. 4 апта бойы инкубациядан кейін дәрісі жоқ ортадағы 10-4 суспензиядан егілген өсу қарқынын дәрісі бар ортадағы 10-2 суспензиядан егілген өсу қарқынымен салыстырады. Егер дәрісі бар ортадағы колониялар саны көбірек болса (1% тең немесе артық), тест жүргізілп отырған штамм төзімді болып саналады.

Туберкулез бойынша профилактикалық
іс-шараларды ұйымдастыру және жүзеге
асыру жөніндегі нұсқаулыққа
18-қосымша

ТҚҰ зертханаларында автоматтандырылған BАСТЕС MGIT-960 жүйесінде сұйық қоректік орталарды қолдана отырып туберкулез ауруын культуральдық әдістермен анықтау тәртібі

1. Туберкулез ауруын сұйық қоректік орталарда культуральдық әдіспен автоматтандырылған BАСТЕС MGIT-960 жүйесін қолдана отырып анықтайды. ТМБ өскен жағдайда (1 мл ортада 105-106 КТБ дейін) аспап сынаманы оң нәтижелі деп бағалап, жарықпен немесе дыбыспен белгі береді. 6 апта (42 күн) бойы өсу байқалмаса, аспап сынаманы теріс нәтижелі деп бағалайды.
2. Сұйық қоректік орталардағы культуральдық әдіс емшарасы бекітілген стандарттарға сәйкес жүргізіледі.
3. Сұйық қоректік орталарға себу II классты қорғанысты ламинарлы боксте жүргізіледі. Түтіктерді жұмыс алдында таңбалайды, таңба жазуы түтіктердің штрих-кодына түспеуін ерекше қадағалау қажет.
4. Теріс нәтижелі түтіктердегі қоректік орталарда өзгеріс байқалса, одан жағынды жасап, микроскопиялық зерттейді және материалды қанды агар (ластануды бақылау үшін) мен Левенштейн-Йенсен ортасына себеді.
5. Оң нәтижені дәлелдеу мақсатында әр MGIT түтігінен жағынды жасап, оларды жалпы нұсқауға сәйкес Циль-Нильсен әдісімен бояйды. Қышқылға төзімді «бұрым» тәрізді колониялар туберкулез микобактерияларының бар екендігіне нұсқайды. Жеке орналасқан қышқылға төзімді бактерия жасушалары анықталса, өсіндіні идентификациялау қажет.
6. Егер аспап оң нәтижелі деп бағалаған түтіктен жасалған жағынды микроскопиясы теріс нәтижелі болса, ал қоректік ортаның өзі мөлдір болса және оның ластанғанына күдік болмаса, түтікті жүйеге тағы қосымша 3 күнге салып қояды. Содан кейін жағынды микроскопиясын қайталайды. Қайтадан жасалған микроскопия теріс нәтижелі болса, ортаны көзбен қарап тексергенде өсудің және ластанудың белгілері болмаса (қанды агарда өсу байқалмаса), сонымен қатар Л-Й ортасында 10 апта бойы өсу белгілері болмаса, сынама теріс нәтижелі болып саналады.
7. Ластанудың мүмкін деңгейі қатты қоректік орталар үшін 3-5%, сұйық қоректік орталар үшін – 7-8%.
8. Микобактериялар түрін ажыртау үшін келесі белгілер қолданылады:
1) өсу қарқыны: M.tuberculosis, M. bovis және белгілі дәрежеде M.kansasii туберкулезді емес микобактериялармен салыстырғанда баяу өседі;
2) сұйық ортада өскен жағдайда ТМБ түйіршік тәріздес болады, туберкулезді емес микобактериялардың көбі ортаны біртегіс аздап лайландырады (M. Kansasii-ден басқалары);
3) оң нәтижелі MGIТ ортасынан жасалған жағындыда туберкулезді микобактериялар кешені/жиынтығы айқын ұйысулар мен жылан тәріздес жіптер (корд-фактор) түзеді, ал туберкулезді емес бактериялар жеке-жеке кішігірім ұйысулар мен жіптер немесе бірен-саран жасушалар түзеді.
9. ДСТ қою:
1) ТМБ туберкулезге қарсы қолданылатын бірінші және екінші қатардағы дәрілерге сезімталдығын BАСТЕС MGIT – 960 аспабында пропорция әдісі негізінде анықтайды. ДСТ үшін қатты қоректік орталармен салыстарғанда ТҚП таза субстанцияларының төмендеу шоғырлануын қолданады (сезімталдықтың жалған нәтижесінен сақтану үшін): стрептомицин – 1,0 мкг/мл; изониазид – 0,1 мкг/мл; рифампицин – 1,0 мкг/мл; этамбутол – 5,0 мкг/мл;
2) ДСТ BАСТЕС MGIT-960 үшін бекітілген нұсқауларға сәйкес жасалады;
3) себінді жасалған түтіктер дәріге сезімталдықты анықтауға арналған арнайы ұстағыштарға қатаң тәртіппен қойылады: бақылау, стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол.
10. Нәтижелерді есепке алу: тест аяқталған соң (14-21 күн ішінде) аспапта нәтиженің дайын болғану туралы қабарлама пайда болады. Оларды алу үшін ұстағыштағы штрих-кодты сканирлеп, есепті басып шығарады, онда әрбір дәрілік заттың ДСТ жазылады: сезімтал (S); резистентті (R), тест нәтижесі анықталған жоқ немесе қате жіберілді (X).
Аспап бақылаудағы өсу бірліктерінің (GU) мөлшері 400 жеткенде (4-13 күн ішінде) нәтижелерін оқи бастайды. Дәрісі бар түтіктегі өсу көрсеткіштерін бағалау:
S – дәрісі бар түтіктегі өсу бірлігі 100 кем емес;
R – дәрісі бар түтіктегі өсу бірлігі 100-ге тең және одан артық;
Х – тест емшарасына әсер ететін кейбір жағдайларда байқалатын түсініксіз нәтижелер (мысалы, бақылау үлгісіндегі өсу бірлігі 4 күннен аз уақытта > 400). Бұндай жағдайда тестті M. tuberculosis жиынтығы деп дәлелденген, таза, белсенді өсіп жатқан өсіндімен қайталау керек.
Кейбір дәріге төзімді штаммдар қоректік ортада өте баяу өседі де, стандартты егу барысында 13 күн ішінде нәтиже алу мүмкін болмайды. Бұндай жағдайда зерттеуді қайталау қажет.
Есеп беру: дәріге сезімталдықты зерттеу нәтижелері дайын болған бетте бірден клиникалық бөлімшелерге жіберіледі. Нәтиже қолданылған әдісті, дәрі түрін және оның шоғырлануын көрсете отырып, «сезімтал» немесе «резистентті» деп белгіленеді.
11. Пиразинамидке сезімталдық тесттілері:
1) пиразинамидке ДСТ анықтауда ортадағы рН деңгейін сақтауға ерекше талап қойылады (in vitro пиразинамид тек қышқыл ортада ғана белсенді) және BАСТЕС MGIT - 960 аспабы үшін ортаның рН көрсеткіші 6,0 аспайтын тест әзірленген; рН мөлшерінің орнын толтыру үшін пиразинамидтің концентрациясы 100 мкг/ мл дейін көбейтілген;
2) BАСТЕС MGIT-960 аспабындағы пиразинамидке ДСТ бекітілген стандарттарға сәйкес жүргізіледі.
12. Екінші қатардағы дәрілерге ДСТ.
Екінші қатардағы дәрілерге ДСТ анықтауға арналған дайын жиынтықтар жоқ.
Реагенттер: екінші қатардағы ТҚП субстанцияларының сыни шоғырланулары есептеледі. Дистилденген сумен немесе арнайы еріткішпен ерітілген дәрілерді автоматты тамызғының көмегімен 0,1мл-ден (100 мкл) таңбаланған MGIT түтіктеріне құйылады. ДСТ арналған өсіндіні дайындау және тесттің өзі жоғарыда сипатталған бірінші қатардағы ТҚП сезімталдықты анықтау емшарасымен бара-бар жасалады.
Екінші қатардағы ТҚП шоғырланулары: амикацин – 1,0 мкг/мл; капреомицин – 2,5 мкг/мл; офлоксацин – 2,0 мкг/мл; этионамид – 5,0 мкг/мл.
Есептеу кезінде 1 г субстанциядағы белсенді заттың мөлшері ескеріледі:
1) офлоксацин мен этионамидті бірінші рет диметилсульфоксидпен (DMSO) ерітеді.
2) сақтауға арналған дәрілерді кем дегенде 0,5 мл (3-4 ДСТ) мөлшерде алу керек, өйткені сақтау барысында олардың шығыны болады.

Туберкулез бойынша профилактикалық
іс-шараларды ұйымдастыру және жүзеге
асыру жөніндегі нұсқаулыққа
19-қосымша

Туберкулез ауруын және дәріге сезімталдықты анықтаудың молекулалы-генетикалық әдістерін (Geno Type ®MTBDR, Xpert MTB/RIF) қолдану тәртібі

1. Рифампицинге төзімділік РНК белсенділігіне жауапты жалғыз rpoB генінде кодталған, изониазидке төзімділік бірден төрт гендегі мутациялармен бақыланады – katG, inhA, ahpC және oxyR, GenoType ® MTBDR plus-тест жиынтығы қолданылады.
2. Рифампицинге төзімділікті анықтау rpoB (РНК полимеразаның бета-суббірлігінің кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анықтауға негізделген. Изониазидке жоғары деңгейдегі төзімділік katG (каталаза-пероксидазаның бөлінуінің кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анықтауға негізделген болса, бұл дәріге төзімділіктің төменгі деңгейі inhA (NADH-Enoyl-АТФ-редуктазаның кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анықтауға негізделген.
3. GenoType ® MTBDR sl-тест жиынтығы 2 күн ішінде ТМБ аминогликозидтер мен фторхинолондарға төзімділікке жауапты гендеріндегі мутацияларды анықтауға мүмкіндік береді, яғни бактериаологиялық анализдердің нәтижесі дайын болғанға дейін көп бұрын науқастарда ДАТ ТБ бар екендігін анықтауға мүмкіндік береді.