Подготовка исследуемого материала

Отбор проб и доставку в лабораторию производят согласно ГОСТ 25386-91 «Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики лептоспироза»

· КРОВЬ, МОЧА: допускается замораживание проб до исследования при температуре минус от18⁰С до минус 20⁰С, 200 мкл исследуемой пробы переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и используют для выделения ДНК.

· ТКАНИ: кусочек ткани измельчают ножницами, растирают в физиологическом растворе или в растворе для выделения №1 (готовят примерно 10% суспензию), 200 мкл суспензии переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и используют для выделения ДНК.

· КОНТРОЛИ: Положительным контролем выделения ДНК служит рекомбинантная культура лептоспир. Размораживать аликвоту непосредственно перед использованием, повторной заморозке не подлежит. Для выделения использовать 200 мкл. Выделенную ДНК (5 мкл) используют для проведения ПЦР. В качестве отрицательного контроля использовать деионизованную воду (200 мкл).

Положительный контроль ПЦР - ДНК лептоспир - размораживать непосредственно перед использованием. В ПЦР использовать 5 мкл.

 

Выделение ДНК

Выделение ДНК из исследуемого биологического материала проводят с помощью Набора I - для выделения ДНК.

Во избежание перекрестной контаминации до начала работы маркируют чистые пробирки объемом 1,5 мл и вносят в них по 200 мкл раствора №1. После этого приступают к работе с инфицированным материалом.

В подготовленные пробирки с раствором-1 (200 мкл) вносят по 200 мкл исследуемого биологического материала (см. п. 3.1.2), перемешивают на смесителе типа «Vortex» и инкубируют 20 мин при температуре 95⁰С в воздушном или водяном термостате. Пробы центрифугируют в настольной центрифуге типа «Эппендорф» в течение 2 мин при 10000-13000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают для проведения анализа, а осадок отбрасывают. Примечание: чтобы избежать самопроизвольного открывания пробирок при нагревании, следует придавить их сверху грузом или использовать специальные пробирки с защелкой.

К надосадочной жидкости добавляют 600 мкл раствора №2 и 40 мкл сорбента (сорбент перед использованием необходимо тщательно ресуспендировать). Смесь тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре (20±2)°С в течение 15 мин. Во время инкубации необходимо 3-5 раз встряхнуть пробирки на смесителе типа “Vortex”, чтобы предотвратить выпадение сорбента на дно. Затем пробы центрифугируют 10-15 сек на микроцентрифуге при 6000 - 13000 об/мин для осаждения сорбента, надосадочную жидкость отбрасывают.

К осадку добавляют 100 мкл раствора №3, суспендируют и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 сек, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза.

К осадку добавляют 100 мкл раствора №4, перемешивают, центрифугируют 15 сек, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза.

Осадок подсушивают в течение 5-10 мин при 56⁰С в пробирке с открытой крышкой.

К осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды для элюции ДНК с сорбента, перемешивают и инкубируют 10-15 мин при 56⁰С в закрытых пробирках, 2-3 раза встряхивая на смесителе типа “Vortex”. Центрифугируют в течение 1 мин при 13000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость используют для проведения ПЦР.

Выделенную ДНК хранят при температуре от минус 18⁰С до минус 20⁰С

Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Для проведения ПЦР используют Набор II - для выявления ДНК патогенных лептоспир методом ПЦР.

ПЦР-1

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на n образцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в количестве и последовательности, указанной в таблице1. Ферменты добавляют в последнюю очередь. При составлении смеси ферменты следует держать во льду.

Таблица 1

Реактив	Кол-во на 1 пробу (мкл)	Кол-во на n проб (мкл)
Буфер для ПЦР-1	15,25	15,25 х (n+1)
Праймеры для ПЦР-1	4,5	4,5 х (n+1)
Термостабильная ДНК-полимераза	0,25	0,25 х (n+1)

Смесь перемешивают, избегая образования пены, и немедленно раскапывают по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки, в каждую пробирку добавляют по 2-3 капли масла (примерно 40 мкл).

Затем в пробирки под слой масла вносят по 5 мкл ДНК соответствующих анализируемых и контрольных образцов. Пробы помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:

94⁰С - 30 сек

55⁰С - 30 сек 25 циклов

72⁰С – 30 сек

 

ПЦР-2

После проведения амплификации проводят реамплификацию аналогично п. 3.3.1, используя смесь для ПЦР-2 (таблица 2).

Таблица 2

Реактив	Кол-во на 1 пробу (мкл)	Кол-во на n проб (мкл)
Буфер для ПЦР-2	15,25	15,25 х (n+1)
Праймеры для ПЦР- 2	4,5	4,5 х (n+1)
Фермент Taq-полимераза	0,25	0,25 х (n+1)

 

В качестве матрицы вносят 5 мкл продукта ПЦР-1. Температурный режим такой же как в п. 3.3.1