Тема: Микробиологическая диагностика холеры.

ЗАНЯТИЕ 19

Цель: На основе знаний биологии холерных вибрионов - возбудителей особо опасной инфекции, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию.

 

Знать:

1. Правила работы с возбудителями особо опасных инфекций.

2. Классификацию, морфо-биологические особенности возбудителя холеры.

3. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при холере.

4. Правила забора и транспортировки материала при диагностике холеры.

5. Методы микробиологической диагностики холеры.

6. Специфическую профилактику холеры.

7. Этиотропную терапию холеры.

 

Уметь:

1.Провести экспресс-диагностику холеры (РИФ).

2. Готовить нативный препарат «раздавленная капля» для определения подвижности и последующей иммобилизации вибрионов холерной сывороткой.

3. Микроскопировать нативный препарат методом фазового контраста.

4. Идентифицировать и дифференцировать холерные вибрионы.

 

Контрольные вопросы:

1. Критерии принадлежности холеры к группе особо опасных инфекций. Правила ТБ при работе с возбудителями особо опасных инфекций.

2. Классификация и морфо-биологические особенности возбудителя холеры.

3. Экология, источники, пути распространения, особенности патогенеза и иммунитета при холере.

4. Правила забора и доставки материала при диагностике холеры, как особо опасной инфекции.

5. Методы микробиологической диагностики холеры.

6. Методы экспресс-диагностики холеры.

7.Специфическая профилактика, основы патогенетической терапии холеры.

 

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести бактериологическое исследование испражнений обследуемого с подозрением на холеру с целью выделения предполагаемого возбудителя:

1.1.Учесть и оценить результаты РИФ с материалом отобследуемого и холерной люминесцирующей сывороткой. Сделать вывод;

1.2.Изучить посев исследуемого материала на щелочной агар:

- отобрать характерные изолированные колонии, дать их описание;

- приготовить фиксированный препарат из характерной изолированной колонии, окрасить его по Граму, промикроскопировать;

- поставить и учесть РА на стекле с О-холерной сывороткой(1:50);

- определить подвижность микроорганизмов в нативном препарате «раздавленная капля» методом фазового контраста, а затем поставить реакцию иммобилизации;

- сделать заключение.

1.3.Описать характер роста выделенной культуры на среде Клиглера; учесть и оценить результаты теста на оксидазу.

1.4.Учесть и оценить результаты:

- посева на «пестрый ряд», среду с полимиксином;

- реакции гемолиза с эритроцитами барана;

- реакции фаголизиса с классическим бактериофагом и фагом эльтор;

- развернутых РА с холерной О-сывороткой и сыворотками Огава и Инаба;

- сделать заключение.

2. Охарактеризовать биопрепараты: холерная агглютинирующая О-сыворотка, типовые агглютинирующие сыворотки Огава и Инаба, люминесцирующая холерная сыворотка, холерные фаги - классический «С» и эльтор, холерная вакцина, холероген-анатоксин.

 

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

1. Проведите поэтапное бактериологическое исследование по обнаружению и выделению предполагаемого возбудителя из испражнений, взятых у больных с подозрением на холеру.

1 этап: Учтите и оцените результаты РИФ с материалом отобследуемого и холерной люминесцирующей сывороткой. Сделайте вывод.

 

Холера относится к особо опасным инфекциям, поэтому работа должна выполняться только специально подготовленным персоналом при тщательном соблюдении всех правил работы с возбудителями ООИ.

Испражнения забирают из предварительно тщательно отмытого от дезраствора судна или с помощью ректальной петли. Наилучшей транспортной средой является 1% пептонная вода с рН 8,2-8,6. Материал необходимо доставить в лабораторию не позднее 2-х часов.

Экспресс-методом является РИФ с люминесцирующей холерной сывороткой и исследуемым материалом (демонстрация). Техника выполнения: приготовленный препарат на стекле помещают в чашку Петри, заливают люминесцирующей сывороткой, кладут комочек мокрой ваты, закрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37^о С 30 мин. После инкубирования препарат отмывают, высушивают и микроскопируют в люминесцентном микроскопе. При положительной реакции на темном фоне видны светящиеся изогнутые палочки – ориентировочно холерные вибрионы.

Исследуемый материал засевают в 1% пептонную воду (так называемая 1-ая пептонная вода) и на чашки со щелочным агаром; инкубируют в термостате при 37^о С - чашки в течение 10-12 часов, пробирки с пептонной водой - 4-6 часов.

Через указанное время пептонная вода мутнеет, на поверхности её образуется нежная серовато-голубоватая плёнка, состоящая из бактерий, легко разрушающаяся при встряхивании. Плёнку специальной изогнутой петлёй диаметром 7-10 мм пересевают на вторую пептонную воду; одновременно проводят высев на чашки со щелочным агаром.

 

2 этап: Изучите и оцените результаты посева испражнений на щелочной агар. Дайте характеристику выросшим колониям.

Приготовьте фиксированный препарат из характерной изолированной колонии, окрасьте по Граму и промикроскопируйте.

Приготовьте нативный препарат «раздавленная капля» и промикроскопируйте в фазово-контрастном микроскопе.

Поставьте и учтите реакцию иммобилизации с частью отобранной колонии и О-холерной сывороткой.

Поставьте и учтите РА на стекле с О-холерной сывороткой (1:50) и частью характерной колонии.

Полученные результаты занесите в протокол и сделайте вывод.

 

Холерные вибрионы образуют на плотной питательной среде нежные, прозрачные, округлые, выпуклые колонии (S-форма) диаметром 2-3 мм, серовато-голубоватые в проходящем свете. В мазках, окрашенных по Граму, холерные вибрионы имеют вид изогнутых грамотрицательных палочек. Они активно подвижны в нативном препарате и агглютинируются О-холерной сывороткой (1:50).

Типичные колонии пересевают на косяк со щелочным агаром и на комбинированную среду с лактозой и сахарозой, инкубируют в термостате при 37^о С 10-12 часов.

 

На 3 этапе для определения вида выделенной культуры ставят развёрнутую РА с О-холерной сывороткой, проводят посев культуры на «пёстрый ряд» (сахароза, арабиноза, манноза) и OF-тест (среда Хью-Лейфсона); для выявления биовара проводят посев культуры на среду с полимиксином В, ставят реакцию фаголизиса с фагами «С» и эльтор, проводят тест на гемолиз эритроцитов. Для определения серовара ставят развёрнутую РА с типовыми сыворотками Инаба и Огава.

 

Вибрионы, вызывающие холеру, на комбинированной среде ферментируют сахарозу и не разлагают лактозу, а в «пестром ряду» ферментируют сахарозу и маннозу, но не ферментируют арабинозу (1-я группа Хейберга); агглютинируются холерной О-сывороткой.
Вибрионы биовара eltor гемолизируют эритроциты барана, лизируются фагом «эльтор» и не чувствительны к полимиксину В. Вибрионы классического биовара не гемолизируют эритроциты барана, лизируются фагом «С» и чувствительны к полимиксину В.

 

На 4 этапе учитывают результаты исследований, начатых на 3 этапе идентификации выделенной культуры.

Учтите и оцените результаты:

-посева чистой культуры на «пёстрый ряд»и на среду с полимиксином В;

-реакции гемолиза эритроцитов;

-реакции фаголизиса с фагами «С» и «эльтор»;

-развёрнутых РА с О-холерной сывороткой и типовыми сыворотками Огава, Инаба.

На основании полученных результатов идентифицируйте культуру, укажите вид, биовар и серовар. Заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак.лаборатории.

 

П. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепрараты: холерная агглютинирующая О-сыворотка, типовые агглютинирующие сыворотки Огава и Инаба, люминесцирующая холерная сыворотка, холерные фаги -классический «С» и эльтор, холерная вакцина, холероген-анатоксин, указав при этом, что они содержат, для чего и как применяются.

 

Вопросы для самоконтроля:

1. Назовите правила забора и доставки исследуемого материала при диагностике холеры как особо опасной инфекции.

2. Назовите особенности бактериологической диагностики холеры и с какими свойствами возбудителя это связано.

3. Назовите свойства холерных вибрионов, лежащих в основе экспресс-диагностика холеры.

4. Обоснуйте выбор питательных сред, используемых при исследовании на холеру.

5. Назовите тесты дифференциации биологических вариантов возбудителей холеры.

6. Назовите серологические варианты возбудителей холеры и метод их определения.

7. Назовите сроки выдачи окончательного ответа при исследовании на холеру при проведении бактериологического метода.

8. Обоснуйте тактику специфической и неспецифической профилактики холеры.

9. Обоснуйте тактику терапии холеры.

10. Назовите особенность 7-ой пандемии холеры.

11. Дайте характеристику современной эпидемиологической ситуации по холере в России, в Красноярском крае.

 

Литература:

Учебники:

1. Борисов Л. Б Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. - М.: ООО «МИА», 2002.- С. 409-412.

2. Медицинская микробиология, иммунология, вирусология /Под редакцией Л.Б Борисова, А.М. Смирновой.- М.:Медицина, 1994.- С. 322-325.

3. Медицинская микробиология /Гл. ред. В.И. Покровский, О.К. Поздеев. - М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – С 417-429.

4. Поздеев О.К Медицинская микробиология /Под. ред. акад. РАМН В.И. Покровского. –М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 375-381.

 

Практикумы:

1. Борисов Л. Б., Козьмин - Соколов Б.Н., Фрейдлин И. С.Руководство к лабораторным занятием по медицинской микробиологии,вирусологии, и иммунологии. М.: Медицина. 1993. – С. 150-154.

2. Руководство к практическим занятием по медицинской микробиологи лабораторной диагностике инфекционных болезней /Под ред. Ю С. Кривошеина.- Киев, 1986 – С. 109 –118.

 

Лекции по микробиологии.

Тесты программированного контроля 2004г.