Примеры удаленных /включенных векторов, используемых в метанотрофах

Название плазмиды	Репликон	Селективный маркер	Виды (ссылка)	Примечания
pAYC6	RK2/RP4 (IncP)	Km	Methylomicrobium album BG8 (Berson and Lidstrom, 1997)	????????
pK18mob	pBBR1	Km	Methylosinus trichosporium OB3b (Stafford et al., 2003), Methylococcus capsulatus Bath (Csaki et al., 2003)	??????
pCM184	pBBR1	Tc, Amp, Km	Methylocella sylvestris (Crombie and Murrell, 2014) Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (Ojala et al.,2011	???????????
pSUKSM	RK2/RP4 (IncP)	Km	Methylomonas sp. st. 16a (Ye et al., 2007)	?????????7
pJQ200SK	RSF1010 (IncQ)	Gm	Methylococcus capsulatus Bath (Welander and Summons, 2012)	??????????????7
pCM433kanT	RK2/RP4 (IncP)	Km	Methylomicrobium buryatense (Puri et al., 2015)	?????????

 

1.3. Метанотрофы по сравнению с модифицированными штаммами для биотрансформации метана на основе биокатализа

Для того, чтобы в полной мере реализовать потенциал промышленного биокатализа метана, решающее значение будет иметь правильный выбор производственного штамма. Модель промышленных «рабочих лошадок», такие как E.coli и дрожжевые штаммы имеют несколько преимуществ, включая быстрый рост, обширную базу знаний с длинной историей развития и современные молекулярные методы быстрого конструирования обмена веществ (Balasubramanian et al., 2010). Тем не менее, экспрессия в полной мере активной pMMO, используемой в механизме окисления метана в гетерологичном штамме до настоящего времени не сообщалось. Только растворимый домен бета-субъединицы pMMO был экспрессирован в E. coli, и в этом случае ее активность является довольно низкой. Кроме того, воспроизводимая активность окисления метана не была обнаружена для sMMO при экспрессии в не-метанотрофах. (Jahng et al., 1996; West et al., 1992). Эти результаты свидетельствуют о трудностях, связанных с созданием не-метанотрофных штаммов со способностью к метаболизму метана и предполагаю, что потребуется значительный прорыв для достижения этой цели. В недавнем отчете подробно применяются НАД-сшитые системы окисления метанола в сочетании с экспрессией двух генетических кодов рибулозомонофосфатного пути для достижения превращения метанола в метаболические интермедиаты в E.coli по оценке 13С-маркирования (Miller et al., 2015). Это важный шаг в достижении метанотрофии в не-метанотрофах, хотя до сих пор эти усилия не привели к росту. Это является важным шагом в достижении метанотрофии в не-метилотрофах, хотя до сих пор такие усилия не привели к успеху. Вполне вероятно, что некоторые сочетания высокой производительности комбинаторного геномного скрининга и селекции, в конечном итоге, прогнозирует рост на метаноле и позже, рост на метане.

Альтернативой гетерологичного хозяина является использование существующих метанотрофибактерий Аеэробные альфа и гамма протеобактерии метанотрофов генетически модифицируются, и некоторые виды имеют довольно высокие темпы роста (например, 2-3 ч время удвоения для Methylomonas зр.; Koffaset al., 2001)

 

По крайней мере, некоторые гаммапротеобактерии метанотрофов используют путь Эмбден Мейерхофа Парнас с пирофосфат-связанной фосфофруктокиназой для гликолиза, что увеличивает доступный углерод и энергию по сравнению с предыдущими оценками, которые предполагается использование пути Энтнер Доурдероффа (Kalyuzhnaya et al., 2013; Koffas et al.,2001). Условие входного уменьшения энергии в реакции окисления метана в аэробных метанотрофах ограничивает теоретический и энергитический выход в биокатализе метана до 64% (Haynes и Gonzalez, 2014). Если уменьшать аналоги ростового лимита в этих организмах, образовавшиеся электроныДолжны пойти на полное окисление метана до СО2, тем самым дополнительно ограничивая теоретический выход углерода.Еще раз мы видим, что больше информации о фундаментальной физиологии этих организмов, в том числе источник электронов для pMMO, требуется для точных прогнозов.

В настоящее время изучаются несколько способов повышения теоретической энергии выхода и выхода углерода при биокатализе метана. К ним относятся попытки белковой инженерии клеток, которые могут быть использованы в нативных метанотрофах или гетерологичных штаммах, таких как видоизменение из аэробных ферментов, включая метил-коэнзим М-редуктазу (MCR) из архебактерий для использования в метаногенезе, или метилсукцинат-синтазу.

 

Подробное сравнение этих стратегий см. в обзорной статье Haynes and Gonzalez (2014).

Таким образом, обе ближайшие будущие перспективы промышленного биокатализа метана с использованием аэробных метанотрофов, а также перспективное будущее развития технологий указывают на интересные обширные новые перспективы в этой области.

 

1.4. Примеры биотехнологии, включающей метанотрофов.

Биотехнологический потенциал метанотрофных бактерий широко обсуждается (Anthony, 1982; Trotsenko and Khmelenina, 2008;Smith and Murrell, 2009, 2010; Winder, 2010; Jiang et al., 2010; Feiet al., 2014). Однако лишь немногие продукты на основе метана были сделаны в рамках пилотных и промышленных масштабах и до сих пор ни в одних из них не участвуют штаммы, которые были улучшены путем метаболической инженерии.Среди этих успешных продуктов - микробиологический белок (белок одноклеточных организмов), который был изучен в бывшем СССР, Великобритании, Норвегии и Дании. Белок метонотрофных микроорганизмов производят различные торговые марки, таких как “Гаприн” (Egorov et al., 1990), “Биопротеин” (Nofferm/Calysta) и “Uniprotein” (Unibio С/С). Сегодня работают несколько заводов кормового микробиологического белка на природном газе в качестве сырья, и все они направлены на пищевой рынок как корма/добавки животными (http://www.unibio.dk, http://www.bioprotein. нет, http://www.calysta.com).

Были описаны следующие ограничения использования метана в крупнотоннажных, пилотных проектах,: (а) очень высокой стоимости кислорода, которые составляют до половины всей себестоимости продукции (Zimin, 2008); (б) высокая опасность ферментации, так как смешиваются 2 газообразных вещества с высокой взрывоопасной степенью (О₂ и СH₄); (в) высокий уровень (до 10% биомассы) нуклеиновых кислот, которые требуют дополнительного извлечения и удаления из микробиологического (Yazdian et al., 2005); (D) культура обладает невысокой окислительной способностью (Khmelenina et al., 1992); (е) источник токсичности, из-за скопления примесей в природном газе (н-алканы: и тяжелые металлы) в клеточной биомассе; (ж) высокий риск заражения во время клеточного роста. Последний пункт является одной из главных проблем в микробной промышленном получении микробиологического белка (Adedayo et al., 2011). Загрязнение процесса получения микробиологического белка из метана был найден, чтобы улучшить скорость процесса (Bothe et al., 2002) С другой стороны, загрязнение может негативно повлиять на культуру, вызывать лизис клеток, в результате в биореакторе будут происходить сбои и аварии, что может привести к выходу продукта с характеристиками, менее качественными, чем продукт, одобренный регулирующими органы.

Изучены другие продукты, производимые из метана: поли(3-гидроксибутират (ПГБ), экзополисахариды (ЭПС), метанол (Xin et al., 2004a,b; Park and Lee, 2013); аминокислоты, такие как глутамат, аланин, и эктоин (Trotsenko and Khmelenina,2008), так же производство биодизеля/жиров (Choi et al., 2011; Fei et al., 2014), ферментативного бульона и каротиноидов (Koffas et al., 2005; Ye and Kelly,2012).

II группа культуры метанотрофнов продемонстрировала потенциал для производства мономерных компонентов, таких как эпоксиды (Hou,1984) и полимеры, такие как поли-β-гидроксибутирата (ПГБ) (Zhang et al., 2009).

 

Было показано, что во второй группе метанотрофных бактерий может накапливаться поли-β-гидроксибутирата до 50% сухой клеточной биомассы (Doronina et al., 2008; Criddle et al., 2013).

В настоящее время производство поли-β-гидроксибутирата из метана изучается в ряде компаний США, России и Индии.

Использование метанотрофных бактерий для производства метанола при комнатной температуре и атмосферном давления из дешевого метан содержащего сырья привлекает внимание многих исследователей (Corder et al., 1988; Labinger, 1995; Xin et al., 2004a,b; Cantrell et al., 2008; Park and Lee, 2013). Только II группа метанотрофов, обычно штамм

M. Trichosporium, может быть протестирован, и было показано, что добавление СО2 и ингибиторов MeDH приостанавливает реакцию на стадии образования метанола (Mehta et al., 1991; Furuto et al.,1999; Xin et al., 2004a)

Теоретически реализуемое производство метанола из метана и углекислого газа было показано (Xin et al.,2004b)

 

Однако, в целом, окончательный выход метанола достаточно низкий.

 

До сих пор не было никаких попыток повысить окисление метана посредством генетических манипуляций культур метанотрофнов.

 

Среди других биотехнологических применений метанотрофных бактерий являются: контроль выбросов метана (Streese and Stegmann,2003; Yoon et al., 2009; Huang et al., 2011),биоремедиация (Semrau, 2011) и биовыщелачивания (DiSpirito et al., 2011)

 

Из-за низкой специфичности ММО, некоторые виды загрязнений, такие как Трихлорэтилен, мета-хлортолуол, фенол, хлорфлуоро-бензолы, моно - ди- хлорбивинилы, могут быть кометаболизированы метанотрофами и удалены из почв, донных отложений и грунтовых вод (Semrau, 2011).

 

Электролитический метаногенный/метанотрофный подход является весьма перспективным способом для очистки сточных вод (Guiot et al., 2008).

 

Используются биофильтры на основе метанотрофов для сокращения выбросов метана со свалок (Park et al., 2008;Scheutz et al., 2009)

 

 

Необходимо высокое содержание меди в среде, чтобы метанотрофы приступили к экспрессированию частиц метанмонооксигеназы (pMMО), многие виды производят chalkophore, названный метанобактин (Мб), который связывает медь и уменьшает ее содержание с очень высоким сродством (10^-21М) (El Ghazouani et al., 2011; Kim et al., 2004)

 

Высокая связывающая способность метанобактина сделала его привлекательным для широкого применения в биотехнологии, в том числе в качестве терапевтического агента для контроля гомеостаза меди у пациентов с болезнью Вильсона (Summeret al., 2011; Zischka et al., 2011).

Кроме того, установлено свойство метанобактина связывать многие другие металлы, такие как трехвалентное золото и двухвалентные ионы ртути по механизму, аналогичному механизму связывания ионов меди, что приводит к их иммобилизации (Choi et al., 2006).

 

Это открывает возможность использования метанобактина или метанобактин экспрессирующих метанотрофов с последующим выделением метанобактина для биовыщелачивания и восстановлению окружающей среды.

 

Кроме того, метанобактин может быть использован для производства однородной меди и наночастиц золота (Choi et al.,2006; DiSpirito et al., 2011; Vorobev et al., 2013).

 

Недавно было обнаружено, что метанобактин является предшественником рибосомально вырабатываемого полипептида (Semrau et al., 2013)

 

Тот факт, что метанобактин генетически закодирован, значит, это может быть возможным, использование мутагенеза генома метанобактина с различной особенностью сродства к металлам, таким образом повышается промышленный потенциал этого вторичного метаболита.

 

2. Культуры и их геном.

 

Одним из ключевых аспектов метаболической инженерии метанотрофов является разнообразие культур и генетических приемов инструментов. Ниже приводится обзор этих средств.

 

2.1. Культуры

 

Многие культуры метанотрофов были изолированы и официально идентифицируются характеризуются за последние 4 десятилетия, начиная с классического исследования Whittenbury et al. (1970)

В настоящее время известно 22 официально описанных рода (см. www. methanotroph.org Таблица 2.1 аннотации списка).

 

Как так методы систематики стали более совершенными, некоторые из штаммов, которые были исследованы, переименовали; отслеживание литературы о конкретном штамме довольно сложно.

 

Хотя большинство известных метанотрофов являются облигатных метилотрофами, т. е. способны расти только на одно-углеродных соединениях (главным образом метана и метанола), как отмечалось выше некоторые метанотрофы являются факультативными, т. е. могут использовать мульти-соединения углерода для роста, в основном короткоцепочечные органические кислоты, этанол и алканы. (Semrau et al., 2011; Dunfield and Dedysh, 2014)

 

На сегодняшний день не-метанотрофы показывают рост на углеводах или богатых средах, хотя они является общими для метанотрофов при выращивании в смешанной культуре с гетеротрофными бактериями.

 

Выдающаяся статья Dedysh и Dunfield (2011) описывает процедуры, которые гарантируют, что любые недавно изолированные метанотрофные культуры не были заражены, либо с метанолом-утилизаторе или бактерий, которая использует мульти-углеродных соединения.

 

Основа взаимодействия подобных смешанных культур пока не известна.

 

Ключевые значимые биотехнологические параметры, такие как скорость роста, выход, (способность к генетическому манипулированию), были опубликованы только для небольшого множества метанотрофных культур.

 

Поэтому неудивительно, что сегодня большинство усилий метаболической инженерии сосредоточены на хорошо изученных (описанных) штаммах, такие, как Methylococcus capsulatus Bath, M. trichosporium OB3b and Methylocystis spp.

 

Тем не менее, недавние усилия в культивировании новых метанотрофные видов привели к выделению и охарактеризовыванию различных штаммов, которые могут обеспечить более широкий спектр возможных применений биотехнологии.

 

Ряд экстремально термофильных, психрофильных, ацидофильных, алкалофильных и галофильных метанотрофов также были выделены; таким образом, расширяется физиологический диапазон аэробной метанотрофии (Kalyuzhnaya et al., 1999; Trotsenko and Murrell, 2008; Murrell,2010).

Параметры роста метанотрофных культур существенно различаются и охватывают широкий диапазон рН (1-10), температура (от 4 до 65 1С) и солености (0-10%) (Trotsenko and Khmelenina, 2008)

Как отмечалось выше, некоторые впервые описаные метанотрофные культуры (в группе NC10) могут окислять метан даже в отсутствии кислорода (Ettwig et al., 2009)

 

Поскольку основной фермент окисления метана в этих микроорганизмов pMMO, NC10 культуры могут служить в качестве источника новых ферментов для биокатализа метана, обусловленного внутриклеточной конверсии N-вида в О2.

 

 

2.2. Геномы

Последовательности генома уже изучены практически для всех родов метанотрофных бактерий, либо в качестве полной или предсказанной последовательностей (см. www.methanotroph.org Таблица 5.1).

 

Большинство из этих геномов были проанализированы под покровительством Омега (Организация геномного анализа метанотрофов), консорциум сосредоточен на секвенировании и аннотация геномов многих метанотрофов.

 

Эти последовательности генома- богатый ресурс для сравнительного анализа, а также демонстрации того, что, хотя основные метаболические пути являются подобными, геномы относительно близкородственных штаммов имеют существенные расхождения.

 

Секвенирование геномов включают внедрение в системную биологию методов (анализ экспрессии генов, протеомики, реконструкция регуляторной сети, метаболическая реконструкция и моделирование сети) и быстро становятся основой для более тщательного исследования метаболического потенциала и эволюционных аспектов метанотрофии (Kao et al., 2004; Murrell and Jetten, 2009; Khadem et al., 2011;Campbell et al., 2011; Yang et al., 2013; Kalyuzhnaya et al., 2013;Vorobev et al., 2014; Tamas et al., 2014).

 

 

3. Генетические инструменты

Генетические инструменты, необходимые для метаболической инженерии организма на основе промышленного биокатализа. На сегодняшний день только аэробные альфа- и гаммапротеобактерии метанотрофоф были признаны легко генетически модифицируемыми. Методы генной инженерии похожи на другие модели бактериальных систем, которые будут здесь описаны кратко.

 

3.1. Введение генетического материала

 

Генетический материал в первую очередь вводят в аэробные метанотрофы через сопряжение с донором кишечной палочки

 

Векторы обычно содержат RK2 / RP4 опероны для этой цели.

 

Трехродительском спариваний может быть выполнена с использованием как донорного штамма, содержащего основной вектор, а также штамма, вспомогательной плазмиды, такие как pRK2013 мобилизовывать вектор (Figurski и Helinski, 1979)

 

Triparental вязок может быть осуществлен с помощью штамма-донора, содержащей вектор интереса, а также штамм укрывательство вспомогательной плазмиды, такие как pRK2013

мобилизовать вектор (Фигурский и Хелински, 1979).

 

Двуродительского спариваний используя параметр s17-1 донора штамм, который содержится при комплексной вспомогательные гены, отвечающие за мобилизацию, также являются общими (Саймон и др.,. 1983).

 

Скрещивание производятся на пластинах агара, состоящий из среднего methanotroph, таких как нитрат минеральных солей (НМС) с добавлением питательных веществ, таких как дрожжевой экстакт, чтобы поддержать доноров, и инкубируют в атмосфере, содержащей воздух и метан.

 

Коньюгация обычно проводится за несколько дней до выбора, при этом эффективность существенно различающихся между метанотрофов.

 

Многие метанотрофов устойчивы к 25 мг/мл налидиксовой кислоты, котораяможет быть использована для того чтобы очистить напряжение получателю от нал-чувствительных доноров.

 

Рифамицин-устойчивых штаммов метанотрофов также часто выбирают и используют для этой цели.

 

В некоторых случаях также используется электропорация для введения генетического материала в геном метанотрофов.

 

Электропорация использовалась для внедрения вектора запрагромированной гибели для удаление PMO оперона в Methylocystis sp. st. SC2 (Baani and Liesack, 2008).

 

Система для мутагенеза М. silvеstris типы bl2 путем электропорации линейных фрагментов ДНК также сообщалась. (Кромби и Меррелл, 2011).

 

Разработка протоколов электропорации для получения дополнительных видов метанотрофов значительно ускорит использовании современных инженерных методов метаболизма этих бактерий, и пока еще находится в стадии активного исследования в нескольких лабораториях.

 

 

3.2. Вставка/удаление (нуклеотидов) мутанты

 

Вставки нуклеотдов и их утрата, как правило, реализуются в метанотрофах с помощью обмена маркера через стандартные методы гомологической рекомбинации, используя фланкирующие области не менее 500 пар оснований последовательности генома.

 

Некоторые часто используемые векторы, такие как pCM184, содержат маркеры антибиотика, маркеры используют последовательности loxP, что позволяет удалить и повторно использовать маркер через Cre рекомбиназу (Marxand Lidstrom, 2002).

 

Кроме того, немаркированные мутанты могут быть сконструированы используя системы негативного отбора.

Сахароза в этой системе с помощью sacB успешно используется в нескольких видов метанотрофных бактерий, в том числе M. capsulatus Bath,Methylomonas sp. st. 16a, and Methylomicrobium buryatense (Yeet al., 2007; Welander and Summons, 2012; Puri et al., 2015).

 

Системы транспозонов также использовались для введения мутаций (участка ДНК) в геном метанотрофов.

 

Также была создана система транспозона tn5, используемая для создания мутантов Methylosinus sp. st. 6, способных к азотфиксации. (Toukdarian и Lidstrom, 1984).

 

Эти методы также полезны для внедрения разнообразия отбора и скрининга.

 

Например, мини tn5 система, содержащая промоторные гены каротиноидов, используется в Methylomonassp. st. 16a для выявления мутантов с повышенным выходом каротиноидов (Sharpe et al., 2007).

 

 

3.3. Репликативные векторы

Обширный диапазон репликативных векторов использовался для экспрессии генов в аэробных метанотрофных бактериях.

 

Обычно используются элементы семейства IncP плазмид, хотя возможны и другие репликоны, такие как pBBR и IncQ векторы, о которых также сообщалось (таблица 1).

 

Репликация плазмид, содержащих репортерные гены полезны могут для быстрого зондирования промотора.

 

Репортеры включая GFP, dTomato, катехин диоксигеназой (кодируемая xylE) и бета- галактозидазы (кодируемая LacZ) успешно были использованы в метанотрофах, однако необходимы бесклеточные фрагменты для точных, повторяемых результатов (Ali and Murrell, 2009; Ojala et al.,2011; Puri et al., 2015).

 

Поэтому существует набор генетических инструментов для выполнения всех основных манипуляций в аэробных метанотрофных бактериях, которые могут быть применены к метаболической инженерии.

 

4. Метаболическое моделирование

 

Метаболическое моделирование широко используются для идентификации предполагаемых мишеней для генной модификации, а также для выявления потенциальных воздействий окружающей среды или генетических возмущений на поведение системы; или, в конечном счете, в компьютерном моделировании фенотипа, как руководства стратегии биоинженерии (Lee et al., 2008; Zelle et al.,2008; Lee et al., 2012; Karr et al. 2012; Esvelt and Wang, 2013).

Были созданы метаболические модели.сосредоточенные на С₁-метаболизме, в основном пути превращения метанола (VanDienandLidstrom, 2002; Peyraud et al., 2011).

 

Потенциал метаболического моделирования в экологических исследованиях круговорота и биокатализа метана рапознавался на протяжении многих лет, подводя к разработке комплекса кинетических моделей и моделей превращения метана (Sipkema et al., 2000; Yoon and Semrau, 2008)

Однако, в отличие от других моделей на основе С₁, основанные на теоретических расчетах утилизации метана, как правило, показывает очень слабую корреляцию с измеренными параметрами (Leak and Dalton, 1986)

 

Доступ к полной последовательности генома метанотрофных бактерий предоставило новые подходы "сверху вниз" для начальной метаболической реконструкции (Santos et al., 2011).

 

Размах генома биохимической сети – воссоздается в биотехнологически важных метанотрофных бактериях, доступных в BioCyc (http://www.biocyc.org).

 

Однако, эти данные основываются на автоматической реконструкции, которые должны быть тщательно оценены в соответствии с опубликованными данными для микроорганизма интереса (субстрат потребления и накопления биомассы, анализ состава биомассы, метаболический путь проверки ферментативной активности, экспрессию гена/белка) и преобразуется в математическую модель, которая может быть проанализирована посредством ограничения на основе подходов линейного программирования, таких как COBRA (http://opencobra.sourceforge.net/open COBRA/Welcome.html) или PathwayTools (bioinformatics.ai.sri.com/ ptools). В идеальной ситуации, реконструкция должна быть дополнительно подтверждена путем сравнения предсказаний модели с фенотипическими данными.

 

Два критических фактора продолжают тормозить развитие комплексных расчетных моделей: отсутствие фундаментальных знаний о биоэнергетике (например, источника энергии для толчка активации метана и компонентов электрон-транспортной цепи), а также комплекс внутриклеточных структур, включая ICMs,, которая предполагает разделение метаболических путей на составляющие части.

 

После проверки GSM-FBA модели, которые хорошо зарекомендовали себя как микробные катализаторы, таких как capsulatus М. и М. trichosporium, которые доступны, они станут мощным инструментом микробной инженерии для увеличения производства отдельных метаболических вторичных метаболитов в метанотрофных микроорганизмах.

 

5. Потенциальные цели для метаболической инженерии

Целый ряд различных продуктов может быть изготовлен из метана с использованием метанотрофных бактерий. Поскольку метан преобразуется в высокоэнергитичный пируват первой I группы метанотрофов и ацетил-КоА второй II группы метанотрофов, существующие инженерные стратегии обмена веществ для производства продукции из этих двух интермедиатов теоретически могут быть “за”, для метанотрофного обмена веществ (Рис. 3).

 

Кроме того, в I группа метанотрофов, различные Сахара, безусловно, синтезируются на высокой ступени в некоторых штаммах (Рис. 3) включая сахарозу и гликоген (полимер глюкозы), который открывает возможность использования метанотрофов для преобразования метана в продукт, который затем может быть использован существующим промышленным штаммом (Eshinimaev и соавт., 2002; Koffas и соавт., 2005). Ниже представлены некоторые примеры конкретных метаболических технических подходов.

 

 

5.1. Увеличение выхода пирувата и ацетил-КоА.

 

Чтобы улучшить промышленный штамм, который экспрессирует пируват или ацетил-КоА-производные продукты, будет предпочтительно увеличить выход этих ключевых промежуточных продуктов.

Ряд модификаций может быть предсказан как потенциально приносящих пользу(Рис. 4).

Так гликоген и EPS являются основным запасающим веществом поглотителем углерода/хранения в I группе штаммов, удаление нескольких шагов в их пути биосинтеза сможет увеличить выход сахара-фосфатов, которые могут быть перенаправлены по необходимости в качестве топлива или нужд химического биосинтеза.

Кроме того, удаление выделенных углеводов может улучшить параметры ферментации, особенно в анаэробных условиях (Khmelenina и соавт. 1992).

Аналогичная стратегия может применяться для расширения пути ацетил-КоА во II группе метанотрофов, через исключение накопления функции PHB. Было показано, что при низком содержании О2,метанотрофные культуры переключаются в режим брожения, в результате в ячейке значительного падает выход продукта из-за выделения формиата, ацетата, лактата и Н2 (Калюжная и соавт., 2013).

Для продуктов, не включающих эти выделенные компоненты, удаление ацетат киназы и лактатдегидрогеназы являются очевидными целями. Снижение производства H2-это еще одно ключевое изменение, чтобы увеличить клеточный путь НАДН. Большинство метанотрофных культур обладают, по меньшей мере, одной группой генов дегидрогиназы,в то время как в некоторых есть дополнительно нитрогеназа, которая также может способствовать образованию Н2 с сопутствующим снижением выхода целевого продукта. Таким образом, если N2 рассматривается в качестве источника азота, снижение Н2- коррелирутся со снижение активности обеих систем.

Метаболическая генетическая пластичность I группы метанотрофов предоставляет собой ряд решений для улучшения общего выхода целевых продуктов. Например, гликолитический путь представляет собой основной путь для производства пирувата во всех исследуемых I группы метанотрофов (Калюжная с соавт. 2013). Этот путь, предсказывает выход 1 nadh и 1.7 АТФ при превращении 3 моль формальдегида в пируват. Если биосинтез целевого продукта не требует использование АТФ или НАДН, путь гликолиза не является оптимальным решением, так как это может привести к перепроизводству АТФ, что требует внедрения пустого цикла. Одним из возможных решений является увеличение потока через путь Энтнера-Доудорофа - путь, который преобразует С1-углерода в пируват и над(Ф)Н без дополнительного высвобождения АТФ

Основным источником производства ацетил-КоА I группы метанотрофов является пируватдегидрогеназа и поэтому, этот шаг связан с потерей углерода в виде CO2. Как и в других микробных катализаторов, включение синтетического не-окислительного гликолиза (Богорад и соавт., 2013) может улучшить эффективность конверсии углерода, когда действуют в сочетании с ЭМП-вариантом пути RuMP (Рис. 4). Альтернативной стратегией для повышения эффективности производства ацетил-КоА из метана может быть взаимосвязь цикла серина и RuMP цикла. С учетом того, что весь ряд RuMP метанотрофов обладают большинством генов цикла серина, улучшение обмена веществ, связанного с деятельностью обоих циклов может быть легко реализованаа и проверена.

Следует отметить, что во время производства ацетил-КоА путем окислительного гликолиза или цикла серина, улучшается общая эффективность процесса преобразования углерода, что негативно влияет на выход НАДН, и не может быть разумным решением для продуктов, которые требуют значительного вклада, снижая потребление энергии для биосинтеза.

 

 

5.2. Уравновешивание О2-связанного окисления метана и “брожения на основе биосинтеза”

Пока вид обмена веществ ферментации с участием метана было продемонстрировано на группе I метанотрофных бактерий, важно помнить, что общий процесс потребления метана в этих микробов зависит от О2 через ММО.

 

Просто реализованный подвод О2 не обеспечивает оптимального решения, лимитирование по О2- существенно влияет на общую производительность системы, и потребление метана также может быть сокращено.

 

Однако, метаболическая инженерия должны быть способны обеспечивать прорывы, необходимые при использовании ферментативной функции метанотрофов.

 

К сожалению, очень мало известно о том, как метанотрофные клетки переключаются с режима дыхания на режим брожения и как окисление метана связано с дыханием.

 

Это еще одна область, которую необходимо исследовать для того, чтобы продвигаться вперед.

 

5.3. Производство жирных кислот как производных соединений метанотрофов

 

Как отмечалось выше, оба группы альфа - и гаммапротеобактерий метанотрофов содержат внутрицитоплазматических мембранные системы, такие как pMMO (Энтони, 1982; Semrau и соавт., 2010).

 

Поэтому эти бактерии развивались, чтобы выделять относительно высокий метаболический поток производства липидов, что делает их привлекательными для синтеза жирных кислот, полученных из метана.

 

Учитывая более высокий выход биомассы I группы метанотрофов, они являются более привлекательными штаммами для этого применения по сравнению со II группой штаммов.

 

Так как эти виды генетически послушные, это должно быть возможным, чтобы принять стратегии для метаболической инженерии производства топлива, которые были разработаны в модельных системах, таких как E. coli.

 

Одним из примеров является сверхэкспрессия усеченного цитоплазматического tesA для получения свободных жирных кислот (Стин и соавт., 2010).

 

Эта стратегия была применена также в цианобактерии Synechocystis, тем самым, подтвердив свою широкую применяемость (Лю и др.,. 2011).

 

Кроме того, гетерологичная экспрессия сложного эфира синтазы atfA делает возможным выработку сложных эфиров жирных кислот в некоторых штаммов метанотрофных бактерий, а также триацилглицеридов если присутствует или вырабатывается диацилглицерол (Янссен и Steinbuchel, 2014; Стин и соавт,. 2010). Интригующе, потому что метанол вырабатывается из метана в метанотрофах, это может быть возможным для получения метиловых эфиров жирных кислот(Мэжк) на месте без дополнительных модификаций для синтеза спирта (Фейсела и соавт.,1992). Поэтому перспективно, что некоторые atfA гомологи имеют значительную активность с метанолом для производства FAME (Ли и Ху 2010,).

Эти примеры демонстрируют невероятный потенциал аэробных метанотрофов в качестве платформы для конверсии метана в универсальные жирные кислоты- как производные топлива.