Биосинтез белка у эукариот

Транскрипция,постранскрипция, трансляция и посттрансляция.
1.Транскрипция заключается в создании "копии одного гена" - молекулы пре-и-РНК (пре-м-РНК).Происходит разрыв водородных связей между азотистыми основаниями, присоединения к гену-промотору РНК полимеразы, которая "подбирает" нуклеотиды по принципу комплементарности, и антипараллельности. Гены у эукариот содержат участки, содержащие информацию, - экзоны и неинформативные участки - экзоны. В результате транскрипции создается "копия" гена, которая содержит как экзоны, так и интроны. Поэтому молекула, синтезирующаяся в результате транскрипции у эукариот - незрелая и-РНК (пре-и-РНК).
2.Период посттранскрипции он называется процессинг, который заключается в созревании и-РНК.
Происходит:
Вырезание интронов и сшивание (сплайсинг) экзонов (сплайсинг называется альтернативным, если экзоны соединяются в другой последовательности, чем были изначально в молекуле ДНК). Происходит "модификация концов" пре-и-РНК: на начальном участке - лидере (5') образуется колпачок или кэп - для узнавания и связывания с рибосомой, на конце 3' - трейлере образуется polyА (множество адениловых оснований) - для транспорта и-РНК из мембраны ядра в цитоплазму.
Это зрелая м РНК.

3. Трансляция:
-Инициация
-связывание и-РНК с малой субъединицей рибосомы
-попадание стартового триплета и-РНК - АУГ в аминоацильный центр рибосомы
-объединение 2-ух субъединиц рибосомы (большой и малой).
-Элонгация
АУГ попадает в пептидильный центр, а в аминоацильный центр попадает второй триплет, потом две тРНК с определенными аминокислотами поступают в оба центра рибосомы. В случае комплементарности триплетов на и-РНК (кодона) и т-РНК (антикодон, на центральной петле молекулы т-РНК) между ними образуются водородные связи и данные т-РНК с соответствующими АМК "фиксируются" в рибосоме. Между АМК, прикрепленными к двум т-РНК, возникает пептидная связь, а связь между первой АМК и первой т-РНК разрушается.
Рибосмома делает "шаг" по и-РНК ("передвигается на один триплет).
Таким образом, вторая т-РНК, к которой прикреплены уже две АМК, перемещается в пептидильный центр, а в аминоацильном центре оказывается третий триплет и-РНК, куда из цитоплазмы поступает следующая т-РНК с соответствующей АМК. Процесс повторяется...
до тех пор, пока в аминоацильный центр не попадет один из трех стоп-кодонов (УАА, УАГ, УГА), которые не соответствуют ни одной аминокислоте

- Терминация - окончание сборки полипептидной цепи.
Результат трансляции - образование полипептидной цепи, т.е. первичной структуры белка.
4. Посттрансляция приобретение молекулой белка соответствующей конформации - вторичной, третичной, четвертичной структур.

Особенности биосинтеза белка у прокариот:
а) все этапы биосинтеза происходят в цитоплазме,
б) отсутствие экзон-интронной организации генов, вследствие чего в результате транскрипции образуется зрелая полицистронная м-РНК,
в) транскрипция сопряжена с трансляцией,
г) имеется только 1 вид РНК-полимеразы (единый РНК-полимеразный комплекс), тогда как у эукариот 3 вида РНК-полимераз, осуществляющих транскрипцию разных видов РНК.

 

Вопрос 14 (Каковы механизмы регуляции активности генов у прокариот – схема Жакоба и Моно):

Регуляция синтеза у прокариот (Жакоб, Моно).

Выделили у прокариот Оперон: группа структурных и функциональных генов.

Т.е. перед геном (генами), несущим информацию о структуре каких-либо белков (структурные гены), находится группа функциональных генов (которые "отвечают", определяют процесс транскрипции). К функциональным генам относят: ген- промотор и ген-оператор и находящийся на некотором расстоянии ген-регулятор.

 

Какие механизмы регуляции есть у прокариот?

1. Путем индукции.

а) ген-регулятор "отвечает" за синтез белка-репрессора, который, синтезируясь, соединяется с геном-оператором, препятствуя прохождению РНК-полимеразы к структурным генам. --> транскрипция не идет.

б) в случае появления в среде какого-либо вещества, белок-репрессор связывается с ним --> освобождается участок гена-оператора, и РНК-полимераза, связываясь с геном-промотором, перемещается к структурным генам --> транскрипция (а позднее трансляция) осуществляется.

В данном случае синтез белка "активироваля" поступающим веществом, которое названо индуктором, а сам механизм регуляции - регуляция путем индукции (например, лактозный оперон).

2. Путем репрессии

а) ген-регулятор несет информацию и о белке-апорепрессоре, который синтезируется в неактивной форме --> не связывается с геном-оператором,транскрипция осуществляется.

б) в случае увеличения концентрации конечного продукта (синтезируемого белка), он связывается с апорепрессором и образуется активный "комплекс" - голорепрессор (апорепрессор+синтезируемый белок) --> голорепрессор связывается с геном-оператором и препятстувует прохождению РНК-полимеразы от гена-промотора к структурным генам --> транскрипция блокируется.

В данном случае наблюдается "подавление", остановка синтеза конечным продуктом - механизм путем репресии.

Как только концентрация конечного продукта (белка) снижается, в нем возникает необходимость, комплекс голорепрессор распадается --> траскрипция (и трансляция позже) возобновляется.

 

Вопрос 15 (Каковы особенности регуляции работы генов у эукариот?):

Особенности регуляции генов у эукариот: 1)нет оперонной организации генов.2) Гены, определяющие синтез ферментов рассеяны в геноме. 3)Регуляция транскрипции является комбинационной, т.е. активность каждого гена регулируется большим числом генов-регуляторов. (промотор и энхансер) 4)белки-регуляторы контролируют транскрипцию генов, кодирующих другие белки-регуляторы 5)гормоны – индукторы транскрипции 6) процесс компактизации и декомпактизации хроматина 7) обратная связь между процессингом, сплайсингом и экзон-интронной организацией генов – например изменение схемы сплайсинга при синтезе антител.

 

Вопрос 16 (Жизненный цикл клетки. Митотический цикл, его периоды. Стволовые клетки. Дифференцировка и гибель клеток):

 

Жизненный цикл клеток – период существования от образования клетки до ее собственного деления или гибели:фаза деления, фаза роста, фаза покоя, фаза специализации или дифференциации, фаза зрелости, фаза старения, деление или гибель.

Митотический цикл.

Митоз - непрямое деление клетки, в результате которого сначала происходит удвоение наследственного материала, а затем его равномерное распределение между двумя дочерними клетками. На процесс деления клетки митозом уходит 1-3 часа. Промежуток между двумя клеточными делениями называют интерфазой, продолжительность которой обычно занимает около 90% времени клеточного цикла.

Интерфаза состоит из трех периодов.

пресинтетический период (G1), который начинается сразу же за завершением предыдущего митоза. В этот период в клетке синтезируются РНК и белки, образуется достаточное число органоидов, клетка растет. Количество генетического материала в клетке не меняется. Число хромосом в клетке равно двойному, гаплоидному (2п), но каждая хромосома все еще

состоит из одной хроматиды, то есть из одной молекулы ДНК. Таким образом, формула клетки в этот период — 2п2с;

синтетический период (S) характеризуется тем, что происходит удвоение молекул ДНК, и к концу этого периода каждая хромосома состоит из двух одинаковых хроматид, а значит, из двух абсолютно одинаковых молекул ДНК. Таким образом,формула клетки становится: 2п4с; постсинтетического периода (G2) происходит подготовка клетки к делению: синтезируются белки, необходимые для образования веретена деления и для формирования хромосом; запасается АТФ. Формула клетки не меняется, оставаясь 2п4с.

Непосредственно процесс деления клетки подразделяют на четыре фазы: профазу, метафазу, анафазу и телофазу.

В профазе происходит спирализация хромосом. Оболочка ядра разрушается. Центриоли расходятся к полюсам клетки. Формируется веретено деления — 2п4с.

В метафазе хромосомы располагаются в экваториальной плоскости клетки. Нити веретена деления прикрепляются к центромерам хромосом — 2п4с.

В анафазе центромеры делятся, и хроматиды хромосом расходятся к полюсам клетки за счет укорочения нитей веретена деления. Формула клетки становится 4п4с.

В телофазе заканчивается кариокинез — деление ядра. Хромосомы деспирализуются, образуется ядерная оболочка. А далее происходит цитокинез — деление клетки. В конце телофазы из материнской клетки (4п4с) образуются две идентичные клетки с наборами генетического материала 2п2с.

Биологическое значение митоза в том, что в итоге его образуются две клетки с совершенно одинаковой наследственной информацией. Митоз позволяет увеличивать число клеток в организме, обеспечивая рост, вегетативное размножение, регенерацию и заживление повреждений тела.

 

Ствол клетки – камбиальные клетки, родоначальные в обновляющихся тканях животных (кроветворной, лимфоидной, эпидермисе, пищеварительном тракте и др.) Размножение и дифференцировка ствол. Кл-к восстанавливает потерю специализ. Кл-к при их естественной или аварийной гибели Ст. Кл-кт индивидуальны для каждого тканевого типа. Напр. из ст. кроветв кл-кт обр-ся эритроциты, лейкоциты или мегакариоциты

Дифференцировка – возникновение различий между однородными клетками и тканями в ходе развития особи, приводящие к формированию специализированных клеток, органов и тканей, т.е. приобретаются хим., морфологические и функцион. особенности.

 

Вопрос 17 (Виды тканей по характеру клеточной пролиферации. Обновляющиеся, растущие, стабильные ткани, их характеристика. Митотический коэффициент):

 

Виды тканей по характеру клеточной пролиферации:

1. Стабильные – все клетки находятся в состоянии необратимой дифферненцировки (эмаль зубов, кардиомиоциты, нервная ткань). Неопределяется МК
2. Растущие – количество клеток в ткани увеличивается, так как доля клеток, идущих в митотический цикл, превышает долю клеток, идущих в дифференцировку (эмбриональные, регенерирующие, опухолевые). 40- 45

3. обновляющиеся – происходит размножение клеток, однако общее количество клеток остаётся постоянным, так как половина клеток переходит в необратимую дифференцировку и погибает.
- быстро обновляющиеся – красный костный мозг, эпителий тонкой кишки, эпителий языка, пищевода, желудка, роговицы, эпидермис. 5-35

- медленно обновляющиеся – паренхима печени, почек. – 0.2 – 0.5

 

Митотический коэффициент - сколько раз может делиться клетка

 

Вопрос 18 (Репликация ДНК у про- и эукариот. Удвоение хромосом. Изменение количества ДНК и набора хромосом в различные периоды жизненного цикла клеток):

Репликация у прокариот.

 

Наиболее изучен процесс репликации у Escherichia coli. У этой бактерии (как и ещё некоторых исследованных видов) в области точки инициации репликации (ori C, длиной примерно 245 п.н.) находятся повторы размером в 13 и 9 пар оснований (Рис.5). При инициации 10-20 молекул белка инициации репликации Dna A связывается с четырьмя девятимерными повторами (9-mers) и расплетает ДНК в районе тандемного набора тринадцатимеров, богатых АТ парами (что облегчает их расплетание, т.к. между А и Т только две водородные связи). Белок Dna C доставляет шестисубъединичный белок Dna B (геликаза) к матрице. На каждую из одиночных цепей садится по одному Dna B и они затем двигаются в разных направлениях расплетая ДНК.

 

 

К геликазе присоединяется праймаза и синтезирует РНК-затравку. Две ДНК-полимеразы с помощью своих двух b-субъединиц прикрепляются к нити ДНК и начинают синтез ДНК. Расплетанию спирали способствует SSB-белки, которые связываются с одноцепочечными участками ДНК, предотвращают образование шпилек и тем самым стабилизируют расплетённый дуплекс. Сбалансированное действие топоизомеразы II (гираза), способной индуцировать отрицательные сверхвитки(см.рис.4), и топоизомеразы I, снимающей отрицательные сверхвитки(см.рис.3) регулирует степень сверхспиральности ДНК и таким образом влияет на скорость движения репликативной вилки.

У прокариот обнаружено три типа ДНК-полимераз. Их свойства приведены ниже.

ДНК-полимераза III осуществляет удлинение лидирующей цепи, а также удлинение РНК-праймеров с образованием фрагментов Оказаки длиной от 1000 до 2000 нуклеотидов. Две ДНК-полимеразы связаны между собой субъединицей. Удаление сегментов РНК с 5-конца каждого фрагмента Оказаки и заполнение пробелов между ними катализируетcя ДНК-полимеразой I,способной удлинять цепь и осуществлять ник-трансляцию. Когда растущий 3-гидроксильный конец каждого фрагмента Оказаки доходит до 5 –дезоксинуклеотидного конца соседнего фрагмента, вступает в действие ДНК- лигаза и образуется непрерывная отстающая цепь. Роль ДНК-полимеразы II в репликации не выяснена.

Обнаружен специальный белок терминации – Tus-белок. Он задерживает геликазу, в результате чего прекращается расплетение нити и происходит терминация репликации.

 

Репликация у эукариот.

 

Как и в случае с E.coli исследования репликации в эукариотических клетках сначала были сосредоточены на характеристике различных ДНК-полимераз (см. табл.2).

Следующим этапом стало создание систем для репликации хромосом вирусов животных in vitro. В результате в настоящее время хромосома вируса SV40 может быть реплицирована in vitro с использованием всего лишь восьми компонентов клеток млекопитающих. По своим свойствам эти белки напоминают белки необходимые для репликации в E.coli. Репликация ДНК эукариот также идёт в двух направлениях; для синтеза ДНК нужны праймеры синтезируемые праймазой; синтез лидирующей цепи непрерывен, а отстающей прерывистый. Как показано на рис.7, инициация репликации ДНК вируса SV40 происходит в уникальном сайте, точке начала репликации, путём связывания кодируемого вирусом белка, называемого T antigen, или Tag.

Этот полифункциональный белок расплетает дуплекс ДНК благодаря своей геликазной активности. Расплетание дуплекса требует также наличия АТФ и белка репликации A (RPA), кодируемого клеткой-хозяином и обладающего способностью связываться с однонитчатой ДНК (как SSB-белки в E.coli). Одна молекула ДНК-полимеразы α (Pol α) прочно связывается с праймазой и затем связывается с образовавшейся однонитчатой ДНК. Праймаза образует РНК-праймеры, которые затем удлиняются на небольшую длину Pol α, образуя первую часть ведущих цепей, которые растут от точки ori в противоположных направлениях. Активность Pol α стимулируется фактором репликации C (RFC).

Затем c 3-концамb удлинённых Pol α РНК-праймеров связывается PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и замещает Pol α на обоих растущих ведущих цепях, прерывая их синтез. На следующем этапе Pol δ связывается с PCNA на 3-концах растущих цепей. PCNA повышает процессивность Pol δ так, что полимераза может непрерывно продолжать синтез ведущих цепей. Таким образом, функция PCNA аналогична функции β-субъединицы полимеразы III E.coli, т.к. оба белка образуют сходные структуры (“кольца”), охватывающие ДНК и способствующие удержанию полимераз на цепи ДНК. Они, однако, имеют различные первичные структуры; кроме того PCNA-тример, а не димер как β-субъединица полимеразы III E.coli.

Комплекс праймаза- Pol α. садится на цепь, являющуюся матрицей для отстающей цепи и вместе с RFC осуществляют синтез запаздывающей цепи.

Наконец, как и в E.coli топоизомеразы снимают механическое напряжение, возникающее при расплетании ДНК в репликативной вилке, и участвуют в разделении двух дочерних хромосом. Однако топоизомеразы эукариот имеют некоторые отличия от прокариотических: 1.топоизомеразы I эукариот взаимодействуют с 3-фосфорильным концом разорванной цепи (прокариотические --с 5-фосфорильным концом) 2. топои-зомеразы I эукариот устраняют как отрицательные, так и положительные сверх витки (прокариотиче-ские—только отрицательные) 3.топоизомеразы II эукариот не способны индуцировать образование отрицательных сверхвитков (как это делает в релаксированных кольцевых ДНК гираза бактерий).

Итак, получено много данных об эукариотических белках, осуществляющих репликацию ДНК вируса SV40 in vitro. Как упоминалось ранее, инициация репликации ДНК SV40 in vitro требует наличие вирусного белка - T антигена. Для инициации же репликации у эукариот хромосомной ДНК необходим целый комплекс белков. Так, у дрожжей с сайтом ori в течение всего жизненного цикла связан комплекс из 6 разных белков (ORC), к которому в интерфазе присоединяется ещё целый ряд белков и образованный комплекс инициирует процесс репликации. Такие же белки синтезируются всеми эукариотическими клетками.

Хромосомы эукариот линейны и их концы представлены теломерами, состоящими из повто-ряющихся олигомерных последовательностей; у человека это 25-200 копий последовательности TTAGGG. Наличие специальной области на концах эукариотических хромосом абсолютно необходимо. Дело в том, что при удалении последнего РНК-праймера отстающей цепи, на 5-конце этой цепи остаётся брешь, которую не способна заполнить ни одна из ДНК-полимераз, т.к. всем им для работы необходим праймер со свободным 3-ОН концом. Без существования какого-либо специального механизма дочерняя нить ДНК, синтезируемая на отстающей цепи, укорачивалась бы с каждым клеточным делением. Ферментом, предотвращающим такое укорочение, является теломераза. Этот фермент имеет ассоциированную с ним короткую нить РНК, комплиментарную шестичленной последо-вательности, повторяющейся в теломере и служащую матрицей для синтеза ДНК теломеров. Благодаря этому механизму эукариотические хромосомы могут реплицироваться полностью. Репликация в большинство соматических клеток проходит без участия теломеразы, поэтому с каждым делением длина хромосом клетки укорачивается и после определённого числа делений хромосомы утрачивают теломеры и начинают терять смысловые участки, что приводит к гибели клетки. Теломераза активна в половых, раковых клетках и клетках одноклеточных эукариот.

 

G1 – 2n2c

S –

G2 – 2n4c

Gh – 2n2n

Митоз: 2n4n à2n2c

 

Вопрос 19 (уровни организации хромосом эукариот. Изменение организации (спирализация)хромосом в митотическом цикле клеток):

 

Уровни организации хроматина: ДНК – нуклоеосомная нить – элементарная хроматиновая фибрилла – интерфазная хромонема (укладка в петли, далее глыбки хроматина как компактная структура)– метафазная хроматида (суперспирализация, отдельные хромосомы хорошо различимы). Ядерная структура в интерфазе называется хроматин, в метафазе – хромосома.

Вопрос 20 (Митоз, характеристика фаз митоза. Значение митоза. Эндомитоз, политения. Патологические виды деления клеток):

В профазе происходит спирализация хромосом. Оболочка ядра разрушается. Центриоли расходятся к полюсам клетки. Формируется веретено деления — 2п4с.В метафазе хромосомы располагаются в экваториальной плоскости клетки. Нити веретена деления прикрепляются к центромерам хромосом — 2п4с.В анафазе центромеры делятся, и хроматиды хромосом расходятся к полюсам клетки за счет укорочения нитей веретена деления. Формула клетки становится 4п4с.В телофазе заканчивается кариокинез — деление ядра. Хромосомы деспирализуются, образуется ядерная оболочка. А далее происходит цитокинез — деление клетки. В конце телофазы из материнской клетки (4п4с) образуются две идентичные клетки с наборами генетического материала 2п2с.

Биологическое значение митоза в том, что в итоге его образуются две клетки с совершенно одинаковой наследственной информацией. Митоз позволяет увеличивать число клеток в организме, обеспечивая рост, вегетативное размножение, регенерацию и заживление повреждений тела.

Эндомитоз - кратное увеличение количества хромосом в клетке - появление полиплоидных клеток.
Политения - кратное увеличение количества ДНК.

Амитоз – прямое деление клетки.

Вопрос 21 (Мейоз, характеристика фаз мейоза. Редукция и рекомбинация генетического материала в мейозе. Значение мейоза):
К концу Профазы I центриоли мигрируют к полюсам клетки, формируются нити веретена деления, разрушается ядерная мембрана и ядрышки. Кроссенговер и конъюгация.

• Метафаза I — бивалентные хромосомы выстраиваются вдоль экватора клетки.
• Анафаза I — микротрубочки сокращаются, биваленты делятся и хромосомы расходятся к полюсам. Важно отметить, что, из-за конъюгации хромосом в зиготене, к полюсам расходятся целые хромосомы, состоящие из двух хроматид каждая, а не отдельные хроматиды, как в митозе.
• Телофаза I — хромосомы деспирализуются и появляется ядерная оболочка.

Второе деление мейоза следует непосредственно за первым, без выраженной интерфазы: S-период отсутствует, поскольку перед вторым делением не происходит репликации ДНК.

• Профаза II — происходит конденсация хромосом, клеточный центр делится и продукты его деления расходятся к полюсам ядра, разрушается ядерная оболочка, образуется веретено деления.
• Метафаза II — унивалентные хромосомы располагаются на «экваторе» в одной плоскости, образуя так называемую метафазную пластинку.
• Анафаза II — униваленты делятся и хроматиды расходятся к полюсам.
• Телофаза II — хромосомы деспирализуются и появляется ядерная оболочка.

Происходит редукция (уменьшение) числа хромосом и переход клеток из диплоидного состояния в гаплоидное; рекомбинация – перемешивание наследственного материала.

Значение

У организмов, размножающихся половым путем, предотвращается удвоение числа хромосом в каждом поколении, так как при образовании половых клеток мейозом происходит редукция числа хромосом.

Мейоз создает возможность для возникновения новых комбинаций генов (комбинативная изменчивость), так как происходит образование генетически различных гамет.

Редукция числа хромосом приводит к образованию "чистых гамет", несущих только один аллель соответствующего локуса.

Расположение бивалентов экваториальной пластинки веретена деления в метафазе 1 и хромосом в метафазе 2 определяется случайным образом. Последующее расхождение хромосом в анафазе приводит к образованию новых комбинаций аллелей в гаметах. Независимое расхождение хромосом лежит в основе третьего закона Менделя.

 

Вопрос 22 (регуляция пролиферации и дифференцировки клеток):

Регуляция пролиферации и дифференцировки клеток: геномная, внутриклеточные и тканевые регуляторы (фактор роста нервов, др), индукция клеточная и частей органов, целых органов и частей системы друг на друга, гормоны. Мутации как сбой регуляции.