Условия культивирования протопластов

Методы выделения изолирования протопластов из растительных тканей

Методы выделения протопластов изучает такая наука как биотехнология, а именно ее область генная инженерия.

Биотехнология — это производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов, культивируемых клеток и биологических процессов.

Генная инженерия - раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине и осуществлять контроль за синтезом необходимых метаболитов клетки. В ее основе лежит использование методов культивирования изолированных клеток и тканей на искусственной питательной среде в регулируемых условиях.

Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический метод. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации и был улучшен.

Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:

· одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток),

· клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу,

· клетки не повреждаются,

· метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

· обработка ферментами,

· выделение протопластов из клеточных стенок,

· отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

Существует стандартная методика выделения протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum:

В ее основе лежит погружение зрелого листа растения в этонол, а затем в гипохлорит кальция. Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки.

Условия культивирования протопластов

Важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15о. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования.

Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур.

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк).