II. Діагностика грипу птиці

Грип птиці діагностують на підставі епізоотологічних даних, клінічних ознак, результатів патолого-анатомічного розтину та лабораторних досліджень.

Для дослідження направляють трупи птиці одразу після її загибелі або хвору птицю (не менше 5 голів з пташника, вигулу, вольєра, партії або населеного пункту), внутрішні органи (легені, селезінку, печінку, серце, нирки, трахею, кишечник) та головний мозок (у замороженому вигляді або в 50 % розчині гліцерину) та 20 проб сироваток крові від птиці кожного пташника (вигулу, вольєра, партії або населеного пункту) та мінімум 20 трахеальних та клоакальних мазків чи проб посліду (1 г) тощо (стандартний набір зразків). Проби свіжого посліду відбираються по діагоналі приміщення (1 г) з розрахунку по 1 г посліду з 60 точок пташника (вигулу, вольєра).

Якщо в господарстві утримується невелика кількість птиці (40‑60 голів), то проби для дослідження відбираються від усієї птиці.

Проби свіжого посліду можуть служити альтернативою клоакальним змивам, якщо вони не можуть бути відібрані від птиці (дрібна, екзотична птиця та птиця, яка не звикла до ветеринарних маніпулювань або дії з якою небезпечні для здоров'я людини).

Відібрані зразки повинні зберігатися за температури вище 1‑4 ^оС, асептично, для чого їх охолоджують на льоду чи на замерзлих пакетах гелю. Якщо транспортування біоматеріалу до лабораторії ветеринарної медицини триває довше 24 год. з часу відбирання, їх заморожують.

Зразки біоматеріалів від птиці можна зберігати до 2 діб за температури 4 ^оС або до 7 діб за температури (‑18‑2 ^оС), для тривалого зберігання їх заморожують за температури ‑70 ^оС.

Сироватка крові може зберігатись за температури 4 ^оС до 5 діб, після чого її заморожують до температури (‑18‑2 ^оС).

Трахеальні та клоакальні змиви доставляють до лабораторії з дотриманням холодового режиму: негайне охолодження після відбору проб з використанням пакетів льоду або холодоелементів з гелю та транспортування в межах 24 год. до державної лабораторії ветеринарної медицини.

Для проведення дослідження методом ПЛР допускається зберігання відібраного матеріалу від птиці упродовж 24 год. за температури 2‑8 ^оС або до 7 діб за температури (‑18‑2 ^оС).

Біоматеріал терміново транспортують у термосі (ємності) з льодом у герметично закритій тарі до лабораторії ветеринарної медицини.

Відбір біоматеріалу для дослідження на грип та транспортування його проводяться, як з інфікованим матеріалом.

До лабораторних досліджень на грип входять:

- серологічні тести, доступні для виявлення специфічних антитіл до вірусу грипу A: реакція дифузної преципітації (РДП), реакція затримки гемаглютинації, прямий та блокувальний ELISA (ІФА);

- виділення збудника на 9‑11‑добових курячих ембріонах з подальшою ідентифікацією збудника одним із таких методів: реакцією дифузної преципітації (РДП) з антисироватками, твердофазним ELISA (ІФА), реакцією затримки гемаглютинації, реакцією інгібіції нейрамінідази, РТ-ПЛР або РТ-ПЛР в реальному часі;

- визначення вірулентності виділеного штаму за індексом інтравенозної патогенності на 6-тижневих курчатах (який більш ніж 1,2 для штамів ВПГП) чи внутрішньовенним зараженням 4‑8‑тижневих курчат (ВПГП викликає загибель 75 % і більше).

Допускається виділення вірусу грипу в культурі клітин.

У випадку виявлення у птиці антитіл до вірусу грипу птиці проводять повторне епізоотологічне обстеження та лабораторні дослідження.

Наявність вірусу грипу птиці визнається, коли:

- високопатогенний вірус птиці був виділений та ідентифікований як такий або має характерну амінокислотну послідовність у місці розщеплення гемаглютиніну;

- низькопатогенний вірус птиці був виділений як такий або має характерну амінокислотну послідовність у місці розщеплення гемаглютиніну.

Виділений ізолят (вірус грипу) передається в референс-лабораторію для проведення відповідних досліджень та зберігання.

Діагноз грипу птиці вважається встановленим, якщо виявлений патогенний вірус, антиген або специфічний генетичний матеріал у зразках від птиці або інших тканинах птиці, органах, крові чи виділеннях, наявні клінічні ознаки захворювання, характерні патолого-анатомічні зміни та відповідні специфічні антитіла.

Офіційні дослідження зразків біоматеріалу птиці проводять уповноважені державні лабораторії ветеринарної медицини.

Методи досліджень

1.1. Метод виділення вірусу. Сутність методу полягає у виділенні вірусу на ембріонах курей і подальшої його ідентифікації.

Апаратура, матеріали і реактиви. Термостат з температурою нагріву 37‑38 ^оС; центрифуга з частотою обертів 3000; центрифужні склянки ємкістю 50‑100 см³; ваги лабораторні з похибкою зважування не більше 0,1 г, подрібнювач тканин; овоскоп; колби конічні скляні ємкістю 10, 15, 20 см³, піпетки пастерівські або піпетки скляні вимірювальні ємкістю 1, 2, 5 і 10 см³; ступка фарфорова; скло кварцове; натрій хлористий 0,8 % або інші дезінфікуючі засоби; натрій лимонно-кислий 3-х заміщений 5 % розчин; йод 5 % розчин; антибіотики - пеніцилін і стрептоміцин; середовища живильні МПБ і МПА; парафін; ембріони курей 9‑10 добового віку.

Еритроцити курей на фізіологічному розчині 0,7 і 1 % суспензія, для приготування якої кров відбирають у птиці або курей у віці 6 міс з підкрильцевої вени в колбу з фізіологічним розчином у рівних об’ємах із розчином лимонно-кислого натрію.

Отриману кров тричі відмивають фізіологічним розчином, еритроцити осаджують центрифугуванням з частотою обертів 1500 упродовж 10 хв. З осаду еритроцитів готують 0,7 або 1 %‑ву суспензію на фізіологічному розчині та зберігають не більше 5 діб за температури 4 °С.

Підготовка до дослідження. Спочатку проводять обробку органів патологічного матеріалу. Для цього патологічний матеріал стерильно виймають з гліцеринового розчину, трикратно ополіскують стерильним фізіологічним розчином і гомогенізують за допомогою подрібнювача тканин або подрібнюють в ступці з кварцовим склом. Гомогенат розводять 1: 10 стерильним фізіологічним розчином і центрифугують з частотою обертів 1500‑2000 упродовж 15 хв. Супернатант переносять в стерильні пробірки, додають 1000 од / см³ стрептоміцину і витримують за кімнатної температури 60 хв.

Проведення дослідження. Для дослідження однієї проби матеріалу (надосадкова 10 %‑ва суспензія) заражають не менше 10 ембріонів. Перед зараженням ембріони попередньо овоскопують, відзначаючи кордон пуги і ділянку між кровоносними судинами для проколу шкаралупи з метою інокуляції дослідного матеріалу. Шкарлупу з боку пуги і місце проколу дезінфікують розчином йоду та фламбують. У центрі повітряного простору і в місці введення дослідного матеріалу роблять пробійником отвір, потім через бічний отвір вводять 0,2 см³ дослідного матеріалу на глибину 2‑3 мм в алантоїсну порожнину. Одночасно роблять висів по 0,2 см³ на поживні середовища МПБ і МПА, які поміщають в термостат за 37‑38 °С. Контролем служать 5 незаражених ембріонів. Після зараження ембріонів отвір у шкарлупі заливають парафіном. Заражені і контрольні ембріони інкубують в термостаті упродовж 24‑96 год. за температури 37‑38 °С і відносній вологості 60‑70 %. У процесі інкубації ембріони овоскопують два рази на добу, загиблі - зберігають в холодильнику за 4 ^оС. Через 96 год. інкубації всі ембріони скривають після попереднього охолодження в холодильнику за 4 ^оС упродовж 10‑12 год.

Перед оглядом ембріонів шкаралупу обробляють йодом і фламбують, та з кожного ембріона окремо збирають екстраембріональну рідину в стерильні пробірки, які висівають на МПБ і МПА та перевіряють на гемаглютинацію (РГА). Реакцію ставлять на склі шляхом змішування рівних крапель екстраембріональної рідини з 1 %‑вої суспензією еритроцитів курей. За негативної РГА зразки екстраембріональної рідини в кількості 1‑2 см³ від кожного зараженого ембріона (не менше 5 ембріонів) об'єднують і знову заражають не менше 10 ембріонів.

Виділення вірусу проводять упродовж 3-х пасажів на курячих ембріонах, перевіряючи в кожному пасажі екстраембріональну рідину на наявність гемаглютиніну в крапельної РГА. Якщо титри гемаглютиніну низькі, проводять ще 2‑3 додаткових пасажів.

Обробка результатів. Результат дослідження проби патологічного матеріалу вважають негативним, якщо в трьох додаткових пасажах не буде виявлено гемаглютинації еритроцитів. За наявності гемаглютинації еритроцитів проводять ідентифікацію виділеного вірусу.

1.2. Метод постановки реакції гемаглютинації. Сутність методу полягає в здатності вірусу грипу птиці аглютинувати еритроцити курей.

Апаратура, матеріали і реактиви - додатково мікротитратор типу Такачі або аналогічний; мікропіпетки; панелі з плексигласу.

Проведення дослідження. Готують дворазові розведення вірусутримуючого матеріалу (супернатант), отриманий після обробки патологічного матеріалу від 1: 2 до 1: 1024. Для цього в ряд лунок панелей з плексигласу додають фізіологічний розчин в об’ємі по 0,2 см³. У першу лунку вносять 0,2 см³ вірусу, троєкратно піпетують і переносять 0,2 см³ в другу лунку і так далі до необхідного розведення. З останньої лунки 0,2 см³ видаляють в дезінфікуючий розчин. У кожну лунку додають по 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії курячих еритроцитів. Панелі струшують і залишають за кімнатної температури на 30 хв.

Контролем служать дві лунки з еритроцитами і фізіологічним розчином у рівному об’ємі по 0,2 см³ кожного. Реакцію гемаглютинації і реакцію затримки гемаглютинації (РЗГА) ставлять також з використанням мікротитратору або мікропіпеток в об’ємі 0,025 см³ у плексигласових панелях з лунками з 0,7 %‑вою суспензією еритроцитів.

Обробка результатів. Наявність на дні і стінках лунок осаду еритроцитів у вигляді перевернутої до гори «парасольки» свідчить про позитивну РГА. За негативної реакції в досліді і контролі еритроцити утворюють на дні лунки диск («ґудзик») з рівними краями.

Титром вірусу вважають певне його розведення, за якого спостерігається повна аглютинація еритроцитів, що відповідає одній аглютинуючій одиниці (1 АО).

1.3. Метод ідентифікації вірусу. Сутність методу полягає у здатності специфічних антитіл нейтралізувати гемаглютинуючу активність вірусу в реакції затримки гемаглютинації зі специфічними грипозними сироватками.

Апаратура, матеріали і реактиви - додатково набір сухих інактивованих антигенів вірусу грипу тринадцяти серологічних варіантів і гіперімунних сироваток для діагностики грипу птиці; апарат Кіппа; водяна баня; крейда або мармур; кислота соляна 30 %.

Проведення дослідження. Після визначення титру дослідного вірусу в кількісної РГА ставлять РЗГА. Спочатку встановлюють робочу дозу вірусу (4 АО), для чого вірус розводять фізіологічним розчином у стільки разів, скільки залишається від ділення на 4 значення гемаглютинуючого титру вірусу.

Наприклад: якщо титр вірусу 1: 256, то робоче розведення буде 256: 4 = 64, тобто в 0,2 см³ розведеного 1: 64 вірусу буде міститися 4 АЕ. Для його приготування в даному прикладі відбирають 63 см³ фізіологічного розчину і 1 см³ вихідного вірусу.

Перед постановкою основного досліду перевіряють правильність вибору 4 АЕ. Для цього на панелі в чотири лунки наливають по 0,2 см³ фізіологічного розчину, потім у першу лунку додають 0,2 см³ фізіологічного розчину, потім в першу лунку додають 0,2 см³ 4 АЕ вірусу і після піпетування 0,2 см³ переносять в другу лунку, потім в третю і так далі. З четвертої лунки 0,2 см³ розведеного вірусу видаляють в дезінфікуючий розчин. Таким чином, в першій лунці має бути 2 АЕ, у другій 1 АЕ, в третій ‑ 0,5 АЕ, в четвертій ‑ 0,25 АЕ. Після цього в кожну лунку додають по 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів. Панель струшують і залишають на 30 хв. за кімнатної температури. За правильного визначення робочої дози (4 АЕ) у першій і другій лунках повинна бути повна аглютинація, в третій ‑ часткова аглютинація, в четвертій ‑ чітко виражений диск («ґудзик») осілих еритроцитів.

Якщо в третій лунці виявляється повна аглютинація, то це означає, що обрана доза вірусу містить не 4 АЕ, а більше. У цьому випадку доза повинна бути зменшена. І навпаки, відсутність аглютинації в другій і частково в третій лунках свідчить про недостатність вірусу. Збільшують або зменшують робочу дозу, додаючи відповідно вірус або фізіологічний розчин і потім повторно перевіряють правильність вибору 4 АЕ.

Для постановки основного досліду в ряд лунок, починаючи з другої, наливають по 0,2 см³ фізіологічного розчину. Потім в першу і другу лунки додають по 0,2 см³ специфічної сироватки. У другій лунці суміш піпетують і переносять 0,2 см³ у третю лунку і так далі до необхідного розведення. Після цього в усі лунки вносять по 0,2 см³ робочого розведення вірусу (4 АЕ). Панелі струшують і після 30-хвилинного контакту сироватки з вірусом в кожну лунку додають по 0,4 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів.

Для точності обліку РЗГА ставлять контроль:

- сироватки (0,2 см³ + 0,2 см³ фізіологічного розчину і 0,4 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів);

- еритроцитів на спонтанну аглютинацію (0,2 см³ фізіологічного розчину ± 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів).

Обробка результатів. РЗГА вважають позитивною, а ідентифікацію вірусу завершеною, якщо специфічна сироватка гальмує гемаглютинуючу активність вірусу не менш ¼ ‑ ⅛ титру, вказаного на етикетці ампули (флакона).

1.4. Метод виявлення специфічних антитіл. Сутність методу полягає у виявленні специфічної здатності антитіл сироватки крові хворої і перехворілої птиці пригнічувати гемаглютинуючу активність вірусу в РЗГА. З цією метою досліджують не менше 20 проб сироватки крові від кожної групи дослідної птиці.

Апаратура, матеріали і реактиви ‑ додатково гліцерин; сухий лід.

Підготовка до дослідження. Дослідні сироватки попередньо розводять у співвідношенні 1: 5 дистильованою водою. Для видалення термолабільних інгібіторів сироватки прогрівають на водяній бані за 60 °С упродовж 30 хв. В ампули (флакони) з антигенами додають фізіологічний розчин (рН 7,2‑7,4) згідно «Настанови по застосуванню набору антигенів і сироваток для діагностики грипу птиці».

Проведення дослідження. Спочатку готують двохкратне розведення сироватки на фізіологічному розчині, починаючи з розведення 1: 5. Далі ставлять РЗГА.

При виявленні в сироватці крові титрів антитіл 1: 10 і вище, її звільняють від неспецифічних термостабільних інгібіторів з метою підтвердження наявності специфічних антитіл до вірусу грипу. Для видалення термостабільних інгібіторів через розведену і прогріту сироватку крові пропускають вуглекислий газ з апарату Кіппа або додають шматочки сухого льоду. Обробку сироватки ведуть упродовж 2‑3 хв. Осад видаляють центрифугуванням упродовж 10 хв. з частотою обертів 1500. Надосадкову рідину досліджують у РЗГА.

Обробка результатів. Титром антитіл у сироватці вважають її останнє розведення, що дало повну затримку гемаглютинації з дослідним антигеном.

Виявлення титру антитіл 1: 10 і вище, але не менше, ніж у 30 % дослідної сироватки є підставою для постановки діагнозу, який повинен бути підтверджений позитивними результатами вірусологічних досліджень.

1.5. Метод ретроспективної діагностики. Сутність методу полягає у виявленні достовірного приросту рівня специфічних антитіл, обумовленого природним розвитком грипозної інфекції в організмі зараженої птиці.

Проведення досліджень. Досліджують парні сироватки, отримані в перші 1‑2 доби на початку захворювання і через 4‑10 діб після першого відбору крові. Сироватку крові звільняють від інгібіторів. РЗГА ставлять з виділеним вірусом або з антигенами діагностичного набору з урахуванням епізоотичної обстановки щодо циркуляції того чи іншого серологічного варіанту вірусу грипу.

Обробка результатів. Чотирьох кратне і більше збільшення титрів антитіл у парних сироватках є підставою для встановлення позитивного діагнозу.