Особые формы грибных пероксидаз

ФЕРМЕНТЫ ЛИГНИНАЗНОГО КОМПЛЕКСА

 

Процесс ферментативного гидролиза целлюлозы осложняется наличием в растительных субстратах лигнина, который заполняет пространство между структурами, состоящими из целлюлозы и гемицеллюлозы. Лигнин механически скрепляет и одновременно защищаетцеллюлозу от прямых внешних воздействий. К микробной деградации лигнин весьма стоек, однако у некоторых микроорганизмов обнаружены ферменты, участвующие в его разложении.

Разложение лигнина является окислительным процессом, в котором участвует ряд окислительных ферментов лигнолитической системы. Освобождению лигнина из лигноуглеводной матрицы способствуют ферменты, участвующие в деструкции полисахаридов и лигноуглеводных связей: β-глюкозидазы, ксиланаза. Кроме вышеуказанных ферментов в процессе трансформации лигнина участвуют и другие ферменты, благодаря которым, осуществляется взаимосвязь между целлюлазами и перекись-зависимыми ферментами лигнолитической системы. Однако основную роль в разложении лигнина играют оксидоредуктазы, спектр множественных форм которых включает:

I. Гемсодержащие ферменты, к которым относятся лигнинпероксидазы (LiP; КФ 1.11.1.14) и марганец-пероксидазы (MnP; КФ1.11.1.13) и широкоспецифичные пероксидазы (КФ1.11.1.7), секретируемые грибами. Ферменты этой группы осуществляют прямое или опосредованное медиатором одноэлектронное окисление ароматических нефенольных метоксилированных или со свободными фенольными группами субстратов до соответствующих радикалов и двухэлектронное восстановление перекиси водорода до воды.

II. Флавиновые оксидазы, к которым принадлежат глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4), пиранозо-2-оксидазы (КФ1.1.3.10), метанолоксидазы (КФ1.1.3.13), арилалкогольоксидазы (КФ1.1.3.7.) и др., восстанавливающие растворенный кислород до перекиси водорода и окисляющие одновременно гидроксильные группы, соответствующего субстрата до карбонильной группы.

I/II. Целлобиозодегидрогеназы (КФ1.1.99.18) – флавогемопротеиды, восстанавливающие феноксирадикалы и катион-радикалы, ионы трехвалентного железа или хиноны и окисляющие одновременно целлобиозу до целлобионолактона.

Ш.I. Медь-содержащие оксидазы - лакказы (КФ1.10.3.2), восстанавливающие растворенный кислород до воды и одновременно окисляющие фенольные или нефенольные субстраты с образованием хинонов или фенокси-катион- радикалов

III.2 Медь-содержащие оксидазы - глиоксальоксидаза и галактозооксидаза (КФ 1.1.3.9), восстанавливающие кислород до перекиси водорода т одновременно окисляющие подходящюю спиртовую или альдегидную группы.

Изменения в структуре лигнина осуществляется не только под действием ферментов, существуют неферментативные механизмы разложения лигнина при участии комплексов ионов переходных металлов; различных редокс–медиаторов; реагента Фентона или системы Fe²⁺+ H₂O_2; пероксид- и супероксид-радикалов.

Рассмотрение систем грибов, участвующих в разложении лигнина, основано преимущественно на материалах обзоров Л.А. Головлевой и М.Л.Рабиновича с сотрудниками.

Лигнинпероксидазы

Лигниндеградирующий фермент, названный впоследствии лигнинпероксидазой (лигниназой) был выделен из культуральной жидкости Phanerochaete chrysosporium - возбудителя белой гнили древесины в 1983 г в виде изоферментов с изоэлектрическими точками в области рН 3,2 – 4,7 и молекулярными массами в диапазоне 38 – 46 кДа. Большинство изоформ являются индивидуальными белками, которые кодируются собственными структурными генами. Число индивидуальных форм лигнинпероксидазы, зависит от природы штамма, условий выращивания и может составлять от 2 до 15. Так как основная часть пероксидазной активности Phanerochaete chrysosporium содержится во фракциях H1 (pI 4,7), H2, H6, H7, H8, H10, то эти формы и получили название лигнинпероксидаз (сокращенно LiP или LP). Их отличительная особенность заключается в способности одноэлектронно окислять диметоксифенильные субстраты с образованием катионрадикальных интермедиатов. Изоферменты, включающие формы H3, H4, H5 и H9 - пероксидазы Phanerochaete chrysosporium, существенно отличаются субстратной специфичностью. Они неспособны к прямому окислению нефенольных субстратов и для проявления каталитической активности нуждаются в присутствии ионов марганца. Поэтому эти формы пероксидаз гриба Phanerochaete chrysosporium получили название марганецпероксидаз, сокращенно MnP. В связи с тем, что обозначение изоформ лигнинпероксидаз в литературе варьирует, то Н3, Н4 и Н5 часто упоминают как изоферменты LiP, а не MnP.

Ферменты, сходные по структуре с основными изоферментами лигнинпероксидазы, обнаружены у некоторых грибов: Bjerkandera adusta, Fomes fomentarius, Ganoderma applanatum, Lentinula degener, Trametes versicolor. Все изоферменты LiP являются мономерными гемогликопротеинами, содержат один протогем IX на молекулу белка и углеводную компоненту, составляющую около 17% (вес.). Принцип укладки полипептидных цепей выяснен для основных изоферментов - LiP H2 и LiP H8. Он принципиально сходен с укладкой пероксидазы хрена (HRP) и закрытой структурой ее активного центра.

Механизм действия лигнинпероксидаз изучался на примере окисления модельных соединений лигнина. Все реакции происходят в присутствии каталитических количеств пероксида водорода, синтезируемого лигнолитическими культурами, и протекают подобно реакциям, катализируемым классической пероксидазой хрена. Пероксид водорода окисляет Fe³⁺ протопорфиринового комплекса лигниназы, что приводит к появлению высокого редокс-потенциала на гем-центре фермента. Взаимодействие фенольных субстратов с активированным ферментом сопровождается переносом электрона с ароматического кольца субстрата на активный центр фермента. В результате одноэлектронного окисления субстрата формируется нестабильный арильный катион- радикал, который подвергается ряду неферментативных реакций. Восстановление лигниназы из активной формы в исходную происходит за счет двух последовательных реакций, в которых участвует новая молекула субстрата - донора электронов. Процесс активации и восстановления лигниназы можно представить схемой:

 

лигнинпероксидаза (Fe³⁺ p) + H₂O₂ соединение I (Fe⁴⁺ (0) p^+.) + H₂O

 

соединение I (Fe⁴⁺ (0) p^+.) + ED соединение II (Fe⁴⁺ (0) p) + ED^+.

соединение II (Fe⁴⁺ (0) p) + ED лигнинпероксидаза(Fe³⁺ p) + ED^+. + H₂O

 

где р - апофермент, ED - электронный донор

 

Особенностью лигнинпероксидазы является то, что она окисляет не только ароматические соединения со свободным фенольным гидроксилом, но и метоксилированные ароматические субстраты, не содержащие фенольной ОН-группы.

Первой стадией окисления деметоксилированных ароматических соединений LiP является образование катионрадикалов. Последний, будучи сам сильным окислителем, не допускает перевосстановления соединения II избытком перекиси до соединения III, либо окисляет это соединение до ферри-LiP с вытеснением супероксид-радикала. Взаимодействие LiP с перекисью может приводить к образованию не менее трех хорошо изученных интермедиатов, обладающих разными скоростями превращения в исходный фермент. Наиболее активным интермедиатом является соединение I, затем следует соединение II, а соединение III, образуемое при восстановлении соединения II избытком перекиси, является наименее реакционноспособным. Для завершения каталитического цикла фермента требуются условия, при которых не накапливалось бы соединение II и особенно соединение III, т.е. специфические субстраты - одноэлектронные восстановители LiP или продукты их превращения должны взаимодействовать не только с соединением I, но и с соединениями II и III и обеспечивать регенерацию активной ферри-LiP.

На рис. 38 представлена серия окислительных реакций катализируемых лигниназой.

 

Рис.38. Реакции окисления, катализируемые лигнинпероксидазами

Катион-радикалы представляют собой короткоживущие промежуточные частицы при окислении ди- и тетраметоксибензолов и их производных. Образование хинонов и других относительно устойчивых продуктов окисления этих соединений включает каскад неферментативных стадий. В зависимости от природы, катион-радикалы ароматических соединений могут подвергаться различным неферментативным превращениям, например, нуклеофильной атаке молекулой воды (как при деметоксилировании диметоксибензолов и их производных с образованием хинонов) или отщеплению протона с образованием незаряженной радикальной частицы, которая запускает различные реакции, например, присоединение супероксид-радикала HOO^., рекомбинацию радикалов или образование пероксирадикалов при реакции с кислородом.

Через стадии образования катион – радикала и присоединения нуклеофильного реагента с последующим отщеплением метанола, лигнинпероксидаза, по-видимому, может катализировать реакцию деметоксилирования. Предполагают, что алкил-арильное расщепление происходит в результате одноэлектронного окисления субстрата под действием лигниназы с образованием феноксирадикала, который далее может участвовать в реакциях алкил-арильного, С_α-С_β расщепления и С_α – окисления.

Для катион – радикала (2) существует возможность (рис.39) двух конкурирующих реакций: деструкция боковой цепи (путь А) и стабилизация с выбросом протона (путь Б), осуществление которых зависит от условий реакции и природы заместителей в алифатической цепи, обуславливающих стабильность радикальных и ионных интермедиатов.

H H O

Лигниназа 1 +

Ar –C –R Ar – C R Ar–C–H +H⁺ + R*

A 3

OH OH

1 2

Б

- H⁺

E

Ar – C* - R Ar – C - R

B - H⁺

OH O

4 5

 

 

Рис.39. Пути стабилизации алкилароматических катион - радикалов

В случае, когда R третичный, вторичный либо бензильный заместитель формируется катион радикал на С_β – атоме, происходит разрыв связи С_α-С_β и образуется альдегид (3). При неразветвленном заместителе R катион-радикальный интермедиат (2) менее стабилен и для стабилизации стремится к выбросу протона с образованием радикала на С_α- атоме (4). В этом случае реализуется путь Б, который приводит к образованию С_α=О метаболитов (5). Возможно окисление и по пути В – непосредственно через радикал. Катион- радикал может реагировать с другими радикалами, присутствующими в среде: ·ООН; О₂ ^-· подвергаться атаке нуклеофилом, что приводит к деметилированию, окислительному расщеплению ароматических колец, образованию хинонов, нециклических диеновых структур.

Для функционирования лигнинпероксидазы большое значение имеет вератровый спирт, по скорости окисления которого оценивают лигниназную активность. Имеются предположения, что вератровый спирт способствует стабилизации LiP; непосредственно участвует в качестве окислителя субстрата в ее реакции с лигнином; индуцирует LiP.

Процессы окисления 3,4-диметоксибензилового спирта - вератрола (VA) до вератрового альдегида (VAD) затрагивают в вератроле и других субстратах, имеющих бензильный атом углерода, в основном, боковую цепь, а не ароматическое кольцо и свидетельствуют об участии молекул воды и растворенного кислорода в некаталитической части реакции.

Наиболее вероятной начальной стадией неферментативного превращения катион-радикала вератрола является выброс протона и образование бензильного радикала. В аэробных условиях этот радикал может присоединить молекулу кислорода с образованием оксибензилпероксирадикала, разложение которого дает супероксиданион и вератральдегид (до 83%). В процессе трансформации катион-радикала вератрола помимо вератральдегида обнаружен ряд минорных продуктов его превращения, частности 2-оксиметил-5-метокси-1,4-бензохинон. Образование хинона может свидетельствовать об атаке мезомерной формы катион-радикала молекулой воды с одновременным деметоксилированием.

Считали, что кислород-зависимое образование побочных продуктов в ходе окисления вератрола под действием лигнинпероксидазы (LiP) начинается с атаки воды на катион-радикал VA·+. В последнее время считают, что VA·+ сначала реагирует с кислородом, а затем подвергается атаке водой. В бескислородных условиях образование вератрового альдегида и побочных продуктов окисления вератрола, очевидно, происходит другим путем.

Одноэлектронный характер окисления диметоксибензолов и их производных с алифатической боковой цепью под действием лигнинпероксидазы позволяет реализовать широкий спектр неферментативных реакций, включающих как стадии окисления, так и восстановления. На стадии окисления катион-радикал участвует в качестве редокс-переносчика. Процессы восстановления запускаются при выбросе катион-радикалом протона либо при окислении и декарбоксилировании им органических кислот.

Скорость образования супероксид-радикалов в неферментативных процессах с участием катион-радикалов, генерируемых лигнинпероксидазой, существенно зависит от структуры исходного субстрата. Так, при окислении 1-(4´-ацетокси-3´-метоксифенил)пропена (изоэугенилацетата, IEA) радикалы супероксида HOO· образуются очень медленно, что объясняют электроноакцепторными свойствами ацетильной группы в ароматическом кольце, делающей удаление HOO· и образование бензильного карбокатиона невыгодным.

Генерируемые лигнинпероксидазой катион-радикалы, как мощные неспецифические вторичные окислители, могут способствовать обратному эффекту - выделению кислорода путем разложения перекиси. Полагают, что кислород образуется в результате одноэлектронного окисления перекиси катион-радикалом вератрола до супероксида, который далее разлагается до перекиси и кислорода. Способность других метоксибензолов вызывать выделение кислорода зависит от их редокс-потенциала.

Таким образом, в катализируемых лигнинпероксидазой (LiPH2) реакциях потребление или образование кислорода зависит от относительных концентраций перекиси и восстановителя - углеродного радикала, образуемого из катион-радикала или из органического аниона. Наличие неферментативных стадий восстановления, сопутствующих окислению лигнинпероксидазы производных диметоксибензолов имеет и реальное значение. В частности, 2-оксиметил-5-метокси-1,4-бензохинон, побочный продукт окисления вератрола под действием лигнинпероксидазы, может служить физиологическим медиатором реакций восстановления, запускаемых грибными пероксидазами. Образование хинона обнаружено в культуре P. chrysosporium при дефиците азота и не наблюдается при достаточном количестве азота. Хинон, восстановленный до семихинона служит редокс-медиатором восстановления цитохрома с в реакциях с Mn³⁺ или MnP, Mn²⁺ и H₂O₂, или LiP и H₂O₂. При этом само восстановление хинона может быть следствием неферментативных реакций, сопряженных с ферментативным окислением вератрола.

Принципиально иной характер носит окисление лигнинпероксидазой ароматических субстратов, содержащих свободную фенольную группу. В процессе окисления эти соединения инактивируют фермент. Фенокси-радикалы при окислении фенольных субстратов не могут участвовать в реакциях переноса заряда. В отсутствие катион-радикалов становится возможной реакция соединения II с перекисью водорода с образованием неактивного соединения III. Типичным примером фенольного субстрата LiP является гваякол. Он окисляется и соединением I, и соединением II LiP с образованием тетрамера. Труднометаболизируемый фенольный субстрат пентахлорфенол окисляется лигнинпероксидазой до тетрахлорбензохинона также через образование феноксирадикала. В литературе имеются сведения, что вератровый спирт ускоряет окисление гваякола и служит посредником в реакции окисления фенольных субстратов лигнинпероксидазой.

Особую группу низкомолекулярных субстратов лигнинпероксидазы составляют монометоксилированные соединения, наиболее известными примером которых является анисовый спирт (анизол, АА) и 4-метоксиминдальная кислота (4-ММА). Монометоксилированный субстрат - анисовый спирт (анизол, АА) способен непосредственно окисляться соединением I до анисового альдегида (AAD) через промежуточное образование катион-радикала с высокой скоростью. Однако АА не окисляется соединением II, поэтому в присутствии этого субстрата стационарное течение реакции определяется незначительной скоростью превращения LiPII в ферри-LiP. Превращение АА в ААD можно осуществить введением косубстрата, способного эффективно окисляться LiPII до катион-радикала, защищающего фермент от перевосстановления перекисью и образования LiP III. Субстратом такого типа является триптофан, обеспечивающий высокую стационарную скорость оборота фермента. Активность лигнинпероксидазы при добавлении триптофана превосходит уровень активности, наблюдаемый в присутствии вератрового спирта. По мнению ряда авторов, триптофан действует не путем индукции - экспрессии лигнинпероксидазы на уровне транскрипции гена, а, вероятно, он препятствует инактивации фермента перекисью водорода. Однако триптофан не ускоряет окисление AA до ААD, а при больших концентрациях его ингибирует. Для эффективного превращения монометоксилированного субстрата типа АА, окисляемого только соединением I, требуется косубстрат, который окисляется преимущественно соединением II LiP и таким образом увеличивающий скорость оборота фермента.

Дополнительный субстрат (косубстрат) может выполнять как медиаторную функцию, так и роль «энхансеров» - усилителей каталитического действия фермента. Под понятием «медиатор» обычно подразумевают соединение, осуществляющее, например, перенос окислительных или восстановительных эквивалентов между ферментом и субстратом либо ферментом и какой-либо матрицей - конечными донорами или акцепторами электронов. Энхансер - более широкое понятие, включающее как указанные функции медиатора, так и любые другие ниже приведенные функции, приводящие к ускорению превращения трудноокисляемого субстрата.

Возможные функции энхансера:

1. Функция редокс-медиатора, если в результате ферментативного окисления энхансера образуется продукт с редокс-потенциалом, подходящим для окисления соединений, не окисляемых напрямую ферментом

2. Завершение каталитического цикла LiP в реакции с субстратами, которые окисляются только соединением I, но не соединением II;

3. Защита фермента от образования соединения III в ходе реакции с избытком перекиси водорода;

4. Перенос окислительных эквивалентов между пространственно разделенными активным центром фермента и нефенольной структурой в составе нерастворимого лигнина или другого высокомолекулярного субстрата

Полагают, что вератрол (VA), как кофактор лигнинпероксидазы может выполнять все четыре функции, хотя в разных реакциях они реализуются в неодинаковой степени. В каталитическом цикле фермента помимо комплекса (LiPII-VA+·) можно допустить существование и других комплексов, например, LiP I-VA, LiP II-VA или ферри-LiP-VA+·, соответствующих разным степеням окисления фермента и кофактора.

Считали, что катион-радикал VA+· является низкомолекулярным агентом, который диффундирует из активного центра фермента в глубь лигниновой матрицы и осуществляет там окисление нефенольных ароматических структур по катион-радикальному механизму с последующим разрывом β-О-4 и Сα-С_β-связей. Однако катион-радикал VA⁺· в свободном состоянии характеризуется малым временем полужизни и, вероятно, менее реакционноспособен, чем в комплексе с соединением II. Это ставит под сомнение его пригодность для выполнения этой функции. Ряд исследователей предполагают, что у грибов могут работать и иные механизмы, стабилизирующие катион-радикал, которые позволяют ему действовать как диффундирующему окислителю, но вопрос об этих механизмах остается пока не изученным.

Лигнинпероксидаза обнаруженная у грибов Phanerochaete chrysosporium, Phanerochaete sanginea, Panus tigrinus, Bjerkandera adjusta, Phlebia radiata, Trametes versicolor, Lentinula edodes, Coriolopsis occidentalis, Trametes hirsita, Merulius tramellosus, Trametes gibbosa и др. проявляет активность обычно в период идиофазы, в ответ на остаток в среде азота и серы. Оптимум активности лигниепероксидазы по отношению к большинству субстратов сдвинут в кислую область (рН 2,7-3,0.). Лигнинпероксидаза быстро инактивируется перекисью водорода, фенилгидразином или азидом натрия, типичными модификаторами δ-мезо-углерода - это атом углерода между метильными группами 1 и 3, обеспечивающий перенос электрона от восстанавливающего субстрата к окисленным интермедиатам фермента.

Уровень активности пероксидазы значительно возрастает в 100% атмосфере кислорода. При окислении лигнинпероксидазой ароматических субстратов кислород отвечает за образование пероксирадикалов, которые могут вовлекать в цепные неферментативные реакции новые молекулы субстрата, ускоряя его превращение. Присутствие кислорода необходимо и для преодоления рекомбинации углеродных радикалов, образуемых при выбросе протона катион-радикалами. Иначе происходит их сшивка и накопление ди- и олигомеров, как при образовании лигнина. Кроме того, продукты восстановления пероксирадикалов ионами Mn²⁺ или другим восстановителем - гидропероксиды - возможно, участвуют во вторичных ферментативных процессах, заменяя перекись водорода.

Mn²⁺ может восстанавливать пероксирадикалы до гидропероксидов, служить ловушкой супероксида и восстанавливать соединение I LiP. Соединение I LiP H2 может осуществлять окисление свободных или хелатированных ионов Mn²⁺ до Mn³⁺ при pH 6,0. Соединения I изоферментов LiP H1, H6, H7, H8 и H10 также легко окисляют Mn²⁺, как и соединение I изофермента H2, однако скорость окисления Mn²⁺ соединениями II этих изоформ чрезвычайно мала. При этом в присутствии Mn²⁺, оксалата и перекиси быстро накапливается соединение III. В присутствии вератрола все изоферменты лигнинпероксидазы способны окислять ионы Mn²⁺ до ионов Mn³⁺, которые могут диффундировать в глубь сетки лигнина и вызывать его окисительную деполимеризацию на значительном удалении от молекул образующего их фермента (LiP или MnP). Повышение концентрации ионов Mn³⁺ является характерным способом перехода от синтеза лигнинпероксидазы к синтезу марганец-пероксидазы (MnP) у грибов Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Lentinula edodes на стадии вторичного метаболизма.

Таким образом, ключевым ферментом в окислении нефенольных структур лигнина до катион-радикалов считают лигнинпероксидазу. Катион-радикалы подвергаются затем ряду неферментативных реакций, включающих расщепление C-C и C-O-связей и фрагментацию трехмерной сетки лигнина. Предложены различные механизмы действия. Согласно одного лигнинпероксидаза может непосредственно действовать на лигнин, окисляя нефенольные структуры в составе лигнина с образованием катион-радикала, приводящим к разрыау Сα-С_β связи, а другой предполагает, что деполимеризация лигниновой матрицы и других высокомолекулярных субстратов опосредуется низкомолекулярным диметоксифенильным медиатором типа вератрола. Окончательно же механизм действия фермента еще не выяснен.

Мn- пероксидаза

В разложении лигнина марганец-пероксидаза (MnP) является вторым по значимости после лигнинпероксидазы ферментом, способным выполнять важную роль на начальном этапе деградации лигнина. Уникальным свойством MnР считается способность непосредственно окислять Mn²⁺ до Mn³⁺ в отличие от лигнинпероксидазы, которая окисляет Mn²⁺ благодаря супероксиданион-радикалу, образуемого в процессе редокс-цикла. Ион Mn³⁺ выполняет роль генератора свободных радикалов, которые в комплексе например, оксалатом, анионом дикарбоновых или α-оксикарбоновых кислот, способны диффундировать в недоступную для гиф гриба часть клеточной стенки растительного субстрата и там осуществлять окисление нефенольных структур лигнина. Возможно также окисление ионом Mn³⁺ подходящих низкомолекулярных медиаторов.

Гриб Phanerochaete chrysosporium одновременно секретирует Мn- пероксидазу и лигнинпероксидазу. Оба фермента кодируются семейством lip генов, 8 lip собраны в кластер, а два находятся на отдельной хромосоме. Промоторный участок Мn -пероксидазы содержит многочисленные элементы теплового шока. На уровне мРНК оба фермента регулируются азотом. Изоферментные формы этих двух ферментов в разной степени репрессируются избытком азота и углерода.

Ряд грибов, например, Phanerochaete chrysosporium,Rigidoporus lignosus, Ceriporiopsis subvermispora, Phlebia radiata, Panus tigrinus, различные виды Pleurotus образуют множественные формы MnP при росте на опилках, соломе или в жидкой среде. Мn –пероксидаза Ceriporiopsis subvermispora способна непосредственно окислять некоторые ароматические амины,а для окисления гваякола необходимо присутствие марганца. У Lentinus edodes MnP окисляет вератрол, но только в присутствии марганца.

В своем составе Мn –пероксидаза содержит протогем IX, который легко отделяется от апофермента и углеводного компонента. Как и лигнинпнроксидаза, MnP является гликозилированным мономерным гликопротеином. Молекулярная масса Мn -пероксиды составляет 45-47 кDа. Фермент окисляет фенольные соединения, полимерные красители, декарбоксилирует ванилиновую кислоту, гидроксилирует ароматические соединения, окисляет орта-пара-дифенолы. Для действия Mn-пероксидазы необходимо присутствие пероксида водорода и Mn²⁺.

Олигомеры лигнина Мn -пероксидаза может окислять в присутствии ионов марганца в качестве редокс-медиаторов. Основная роль ионов Mn²⁺ заключается в предотвращении накопления соединения MnP III, причем в зависимости от условий их защитный эффект может иметь разный механизм.

Важным свойством MnP является ее способность запускать многочисленные инициируемые комплексами Mn³⁺ или вторичными медиаторами неферментативные процессы. Медиатором MnP может быть, например, глутатион, образующий при одноэлектронном окислении ионом Mn³⁺ высокоактивные тиил-радикалы. При отсутствии в среде пероксида водорода Mn-пероксидаза способна окислять некоторые восстановленные соединения, например, NADH, продуцируя Н₂О₂. При этом NADH служит донором электронов.

Таким образом, ключевая роль Mn-пероксидазы, как отмечалось выше, связана с окислением Mn²⁺ до Mn³⁺, который удаляет электрон у фенольного субстрата, образуя радикал, подвергающийся дальнейшим превращениям, а также с генерированием за счет окисления NADH и глутатиона перекиси водорода, которая используется затем лигнинпероксидазой и самой Mn-пероксидазой. Окисление субстратов происходит по схеме (рис.40):

Рис.40.Схема окисления субстратов Mn-пероксидазой.

АН - ароматический субстрат, ДТТ - дитиотрейтол,

G-SH - глутатион восстановленный

 

Активность фермента зависит и от присутствия в реакционной смеси лактата и других α- гидрокислот, необходимых для стабилизации Мn ³⁺. Предполагают, что эти органические кислоты могут облегчить диссоциацию и последующую диффузию Мn ³⁺ от ферментного комплекса.

Мn-пероксидаза обнаружена у грибов Phlebia radiata; Trametes versicolor; Phlebia brevispora; Pleurotus ostreatus; Pleurotus eryngii; Ganoderma australe; Bjerkandera adusta; Phellinus ribis; Poluporus arcularius и др. Однако наиболее изучена Mn-пероксидаза Phanerochaete chrysosporium. Установлено, что фермент данной культуры катализирует деполимеризацию меченных ¹⁴ С синтетических лигнинов с разрывом связей С_ар- С и С_α-С_β, а также осуществляет деструкцию диарилпропановой модели с расщеплением связи β-1 типа. Пероксидаза данного типа из Lentinula edodes расщепляла димер β- О- 4 типа по связи О- С₄ при Б- кольце модели.

Образование Mn-пероксидазой свободно диффундирующих низкомолекулярных окислителей, основным из которых является хелатированный ион Mn³⁺, позволяет ей, наряду с лигнинпероксидазой, участвовать в деполимеризации лигнина in vitro. Однако делает это она опосредованно в отличие от LiP. Участие MnP в процессах делигнификации возбудителями белой гнили in vivo подтверждается аккумуляцией марганца в черных линиях ксилостромы в виде его двуокиси, которая содержат в 100 раз больше марганца, чем не тронутая разложением древесина. Среди грибов, обладающих только активностью MnP, наивысший уровень минерализации ¹⁴C-меченого лигнина при росте в жидкой среде обеспечивает гриб Phlebia radiata. Натуральные еловые ¹⁴C-меченые или дубовые лигнины минерализуются на 58 - 61%, однако в мицелии обнаруживается лишь 12 - 13% ¹⁴C. Столь низкое включение метки в биомассу свидетельствует о внеклеточном характере минерализации лигнина, что может быть объяснено образованием карбоксильных групп или сходных структур при размыкании ароматических циклов MnP с последующим декарбоксилированием ионами Mn³⁺.

Под действием супероксида, углеродных и пероксидных радикалов, которые образуются из органических кислот под действием MnP, фенантрен превращается в бифенилдикарбоновую кислоту, а вератрол в лактон. Не исключено, что у грибов, вызывающих белую гниль древесины имеется и внутриклеточный путь превращения лигнина в углекислый газ, например, при утилизации алифатических дикарбоновых кислот, образующихся в процессе окислительного размыкания ароматического кольца концевых фенольных структур лигнина.

Исходя из изложенного следует, что Mn-пероксидаза служит важным внеклеточным агентом опосредованного воздействия на лигнин и особо значимым свойством является ее способность обеспечивать себя перекисью в результате ряда сопряженных неферментативных реакций восстановления кислорода.

 

Особые формы грибных пероксидаз

У ксилотрофных грибов, принадлежащих к роду Pleurotusи роду Bjerkandera, имеются пероксидазы, характеризующиеся широкой специфичностью. Так, у Bjerkandera sp. обнаружена Mn-пероксидаза (M_r 43000, pI 3,88), которая окисляет Mn²⁺, напоминая типичную MnP, однако в отсутствие марганца осуществляет окисление таких фенольных субстратов, как 2,6-диметоксифенол (DMP), гваякол, ABTS, 3-оксиантраниловую кислоту, o - и п-анизидин и нефенольных субстратов (вератрол) по типу, близким к изоферментам лигнинпероксидазы. Таким образом, свойства лигнинпероксидазы и Mn-пероксидазы совмещены в одном ферменте и в физиологических условиях эта широко специфичная пероксидаза может работать с нефенольными субстратами и в отсутствие марганца.

У Pleurotuseryngii было обнаружено три типа внеклеточных пероксидаз. Одна их них родственна MnP Phanerochaete chrysosporium, вторая представляет собой фермент широкой специфичности, объединяющий каталитические свойства LiP и MnP, включая прямое окисление Mn²⁺, а также прямое окисление фенольных и нефенольных димеров. От типичных Mn-пероксидазы и лигнинпероксидазы она отличается эффективным окислением фенолов (Mn-пероксидазе необходимо присутствие Mn²⁺, а лигнинпероксидазе – вератрола). Третий тип фермента активен по отношению к Mn²⁺ и фенолам, малоактивен к вератролу, неактивен к модельным димерам, что свидетельствует о наличии промежуточного редокс-потенциала между первыми двумя.

Марганец-окисляющие ферменты грибов рода Pleurotus на основе N-концевой первичной последовательности разделены на четыре группы: 1 - пероксидаза PS1 Pleurotus eryngii из твердофазной культуры на пшеничной соломе, пероксидаза MnP2 Pleurotusostreatus из культуры, выращенной на опилках и пероксидаза Pleurotuspulmonarius из твердофазной культуры на пшеничной соломе; 2 - два аллельных варианта пероксидазы Pleurotus eryngi i из жидкой культуры, пероксидазы MnP1 и MnP2 жидкой и твердофазной культуры Pleurotus ostreatus на опилках и пероксидаза жидкой культурыPleurotus pulmonarius; 3 - пероксидаза PS3 твердофазной культуры Pleurotus eryngi i; 4 - пероксидаза Pleurotus ostreatus

Пероксидазы 1 и 2 групп представляют собой ферменты широкой специфичности, которые помимо грибов рода Pleurotus, обнаружены, как было ранее отмечео, в трутовиках рода Bjerkanderа. Эти пероксидазы называют гибридными LiP-MnP пероксидазами. Они окисляют типичные субстраты LiP (вератрол и диметоксибензолы) и имеют разные сайты связывания Mn²⁺ и вератрола. Однако у ферментов из различных видов грибов рода Pleurotus сродство к субстрату в 25-35 раз хуже, чем у MnP грибов Bjerkandera, что свидетельствует об их меньшей специфичности по отношению к нефенольным субстратам. Пероксидазы групп 3 и 4 групп могут рассматриваться как аналоги MnP Phanerochaete chrysosporium.

Результаты скрининга у грибов рода Pleurotus LiP-подобных ферментов с помощью α-кето-γ-тиометилмасляной кислоты (KTBA), выделяющей этилен под действием сильных одноэлектронных окислителей типа LiP Phanerochaete chrysosporium или (OH·)-радикалов, довольно противоречивы. В отечественной литературе имеются сведения о существовании у Pleurotusostreatus ферментов типа лигнинпероксидазы, в то время как зарубежные авторы не подтверждают наличие у грибов рода Pleurotus типичных лигнинпероксидаз среди ферментов окисляющих лигнин либо генов, сходных с lpoгрибаPhanerochaete chrysosporium. Отличия в N-концевой последовательности и различия в специфичности по отношению к модельным димерам показали, что в жидкой и твердой среде грибами синтезируются разные пероксидазы. При рН около 3 в отсутствии марганца они окисляют нефенольные и фенольные соединения, а при рН 4-5 предпочтительными становятся реакции с участием ионов марганца.

У Pleurotus ostreatus кроме типичных Mn-пероксидазы и гибридных пероксидаз обнаружена внеклеточная пероксидаза (PoP) со специфичностью, сходной Mn-пероксидазе, но не требующей ионов марганца для окисления фенольных субстратов. Очевидно, этот фермент не окисляет ионы марганца, в отличие от описанных выше типов Mn-пероксидазы грибов рода Pleurotus.

Грибы Coprinus cinereus образуют пероксидазы, способные к прямому окислению фенольных соединений в стационарном режиме, без участия каких-либо медиаторов. Наиболее изученным примером такого фермента является пероксидаза CIP. Соединение I у CIP образуется при pH 6-11, что обеспечивает более высокую устойчивость фермента к инактивации избытком перекиси.

Полагают, что этот и аналогичные ему ферменты могут отщеплять концевые фенольные группы в полимере и одновременно выполнять функцию защиты лигнинпероксидазы и Mn-пероксидазы от инактивации в процессе окисления фенольных соединений, особенно при повышенной концентрации эндогенной перекиси в среде.

Таким образом, при действии на фенольные и нефенольные субстраты различных типов грибных пероксидаз на первом этапе у всех происходит двухэлектронное окисление фермента гидропероксидом (ROOH) до соединения I (оксоферрил-катионрадикала протопорфирина) с последующим его двухступенчатым одноэлектронным восстановлением сначала до соединения II (оксоферрилгема), а затем до исходной формы фермента, содержащей ферригем. Основные различия заключаются в используемых на разных стадиях одноэлектронных донорах, а также сопряженных неферментативных реакциях.

Лигнинпероксидаза на первой стадии может окислять как фенольные, так и нефенольные субстраты, а на второй только нефенольные, образующие катионрадикальные интермедиаты. Mn-пероксидаза на первой стадии может окислять не только ион Mn²⁺, но и различные фенольные субстраты, но завершать каталитический цикл обязательно должен ион марганца.

У гибридных ферментов, образуемых различными видами грибов рода Pleurotus и рода Bjercandera набор окисляемых субстратов более широк и они кроме ионов марганца, которые могут окислять как соединение I, так и II, способны окислять как фенольные, так и нефенольные соединения, с образованием катион-радикальных продуктов. Субстратная специфичность гибридных ферментов в значительной степени определяется рН. Грибные пероксидазы типа CIP наиболее активные в нейтральной области рН, окисляют фенолы как соединением I, так и II. Соединение II окисляет фенольные субстраты, не подвергаясь инактивации и не требуя косубстратов типа Mn²⁺ или вератрола.

Наличие разных типов пероксидаз у одного и того же деструктора лигнина позволяет ему адаптироваться к разным условиям функционирования.

 

Лакказы

У многих ксилотрофных грибов, почвенных сапрофитов и фитопатогенных грибов обнаружены ферменты лакказы (п-дифенол: кислород оксидоредуктазы, КФ. 1.10.3.2), способные трансформировать ароматические субстраты и выполняющие важную роль в процессах морфогенеза грибов и растений. Кроме потребления лигнина, дифференцировки и образования плодовых тел грибов, лакказы участвуют в процессах адгезии фитопатогенов к клеткам растения-хозяина, гумификации органических остатков, детоксикации ксенобиотиков. Наиболее активными продуцентами лакказы являются ксилотрофные грибы, мицелий которых защищен от вредного воздействия образующихся при разложении лигнина токсичных соединений благодаря лакказе, катализирующей реакции полимеризации токсичных продуктов.

Присутствие лакказы в культуральных фильтратах доказано для большинства лигнинразрушающих грибов, в том числе: Coriolus (Trametes) versicolor, Coriolus hirsutus, Coriolus zonatus, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus eryngii, Panus tigrinus, Fomes sp., Cerrena maxima, Coriolopsis polysona, Hirneola nigricans, Rigidoporis sp., Phellinus sp., Lentinus tigrinus, Clitocybula dusenii, Nematoloma frowardii, Pholiota mutabilis, Collybia sp., Armillariella sp., Coprinus cinereus, Phlebia brevispora, Poria cinerescens, Bjerkandera adusta, Ganoderma lucidum, Irpex lacteu и др. У Phanerochaete chrysosporium отмечен довольно низкий уровень активности лакказы.

Большинство грибов образуют несколько изоформ лакказы, молекулярные массы которых сильно варьируют и находятся в пределах 40-140 кДа. Так Ganoderma lucidum образует пять форм лакказы (Lac) с pI 3,0; 4,25; 4,5; 4,8 и 5,1 и Mr 40000 - 66000. Из гриба Pleurotus ostreatus выделено две изоформы лакказы, которые являются мономерными белками с 3-9% углеводов и молекулярной массой 60 кDа.

Лакказа является гликопротеином и содержит в зависимости от вида продуцента до 40% углеводов, которые, вероятно, защищают ее от инактивации радикалами – продуктами реакции. Углеводная часть лакказы представлена маннозой, N- ацетил-глюкозамином и галактозой в соотношении 6:2:0,6.

Синтез лакказ может быть как конститутивным, так и индуцированным. Активными индукторами синтеза являются катионы меди. У некоторых грибов синтез лакказы стимулируют натуральные лигноцеллюлозные субстраты (опилки или солома) и другие источники углерода. Стимуляцию синтеза лакказы у ряда возбудителей белой гнили вызывает вератрол, а у фитопатогена Botrytis cinerea синтез лакказы увеличивает пектин. Среди индукторов синтеза отмечены гваякол, таннин, феруловая, сиреневая и синаповая кислоты, сирингалдазин. Гриб Ganoderma lucidium активно синтезирует лакказу на питательной среде богатой азотом в присутствии глюкозы, при внесении в среду культивирования дополнительного стимулятора синтеза - сирингильной кислоты синтез лакказы значительно повышается.

Субстратная специфичность фермента определяется редокс- потенциалом окисленных соединений фермента. Редокс-потенциал лакказ составляет 0,8- 1,0 v., что намного ниже, чем у классической пероксидазы хрена. В этой связи лакказы были предложены в качестве ферментного маркера в энзимсвязанных иммуноанализах для замены пероксидаз хрена (НRР). Кроме того, были разработаны различные биосенсорные устройства для измерения кислорода газовой фазы, содержания фенолов в воде, фруктовых соках, чае и других напитках.

Лакказа – медь-содержащий фермент, катализирующий процесс четырехэлектронного восстановления молекулы кислорода до двух молекул воды. Лакказы лигнинразрушающих грибов способны генерировать активные свободнорадикалье частицы (рис.41).

Рис.41. Образование радикалов под действием лакказы

 

Большинство лакказ относится к так называемым «голубым» медь-содержащим ферментам, вклющающим четыре атома меди, функции которых различны. По структуре активного центра их принято делить на три типа: 1) Т1, «голубой» медный центр, характеризующийся полосой поглощения около 600 нм с коэффициентом экстинкции около 5000 М^-1см^-1 в видимом спектре фермента и слабым параллельным сверхтонким расщеплением в спектре ЭПР; 2) Т2 - моноядерный медный центр, который не проявляется в электронном спектре, но характеризующийся в спектре ЭПР параллельным сверхтонким расщеплением, типичным для нормальных ионов меди в тетрагональных комплексах; 3) Т3 – биядерный медный центр, в котором ионы двухвалентной меди спарены антиферромагнитно через мостичный гидроксид.

Структура нативной лакказы до сих пор пока окончательно не расшифрована. При моделировании активного центра лакказыCoprinus cinereus иCoriolus (Trametes) hirsutus, удалось выяснить, что полипептидная цепь фермента уложена в три купредоксин-подобных β-сэндвича. Три иона меди Т2- и Т3-центров сближены на расстояние, не превышающее 3,8 Å и образуют трехъядерный кластер, а ион меди центра Т1 расположен от них на расстоянии не менее 13 Å.

Реакции с участием лакказы включают три стадии: a) связывание субстрата-восстановителя в T1-кармане и последующее восстановление T1-Cu²⁺ до Cu¹⁺; б) внутренний перенос электрона от T1 к T2/T3-кластеру; в) связывание и последующее восстановление молекулы O₂ до H₂O в T2/T3-кластере. В щелочной среде кислород восстанавливается на трехъядерном Т2/Т3 кластере до гидроксил-ионов, а не до молекул воды, как в кислой среде. Так как ОН-анионы прочно связываются с ионами меди, то при повышении рН происходит торможение реакции вплоть до ее полной остановки. Эффект торможения можно также наблюдать в кислой среде, если вместо ОН-анионов использовать их аналоги – фторид- или хлориданионы.

В литературе имеются сведения о том, что ионы меди в активном центре лакказ могут в процессе биосинтеза, по-видимому, частично замещаться ионами других металлов. Например, у вешенки обнаружены две формы лакказы. Одна из них, как и большинства других лакказ, индуцируется избытком ионов меди, имеет максимум поглощения в голубой части видимого спектра и содержит четыре иона меди. Вторая содержит один ион меди, два иона цинка и один ион железа, и не имеет максимума поглощения около 600 нм. Вместо этого у нее наблюдается широкий максимум поглощения при 400 нм. Единственным отличием обоих ферментов от других лакказ является отсутствие активности по отношению к гваяколу.

По субстратной специфичности близки к лакказам полифенолоксидазы (К.Ф. 1.14.18.1) и катехолоксидазы (К.Ф. 1.10.3.1), но так как в их спектре не обнаружен выраженный максимум поглощения около 600 нм, лакказами их не называют. Исчезновение характерного максимума поглощения при сохранении каталитической активности может быть обусловлено частичной заменой ионов меди в активном центре на другие ионы металлов и являться одним из путей возникновения таких ферментов. Так в «белой» лакказе три иона меди заменены на два иона цинка и один ион железа. Цинк- и медьсодержащим ферментом, восстанавливающим кислород, является супероксиддисмутаза (СОД), которая переносит лишь один электрон в процессе окисления-восстановления супероксида. В пероксидазах роль одноэлектронного донора могут выполнять остатки триптофана или тирозина, способные образовывать свободнорадикальные интермедиаты. Для таких медь-содержащих ферментов как галактозооксидаза и глиоксальоксидаза характерен тирозиновый радикал. Тирозин является специфическим субстратом других медьсодержащих ферментов – тирозиназ, которые могут окислять каталитически важный остаток тирозина в структуре лакказ с образованием ароматических продуктов семихинонной или о-хинонной природы, способных принимать и отдавать один или два электрона и исполнять роль кофакторов-медиаторов в реакциях, катализируемых лакказами.

В составе лакказ ряда грибов, выращенных на натуральных лигноцеллюлозных субстратах, преимущественно на пшеничной соломе обнаружены соединения неидентифицированной ароматической природы. Эти лакказы не имеют характерного максимума поглощения в голубой области видимого спектра и характеризуются желтой окраской, по этой причине они получили название «желтых» лакказаз. Для них характерно прямое окисление нефенольных субструктур лигнина, не требующее присутствия иных медиаторов, за исключением фиксированных на белковой глобуле. При культивировании грибов на синтетических средах такие ферменты получить не удается, так как в этих условиях грибы синтезируют обычные «голубые» лакказы, которые идентичны желтым лакказам по строению полипептидной цепи, но не окисляющие непосредственно нефенольных структур.

Большинство лакказ окисляет ароматические соединения со свободным фенольным гидроксилом типа гидрохинона, катехола, гваякола, сирингола, их производных (п-кумарового, кониферилового, синапового спирта, феруловой, кофейной, синаповой кислот), соответствующих лигнанов, норлигнанов, олиголигнолов, галло- и эллагитаннинов, флобатаннинов, о- и п-аминофенолов, ароматических о- и п-диаминов. Они участвуют в непосредственном окислении одноэлектронных восстановителей, потенциал ионизации которых не превышает редокс-потенциала иона меди Т1-центра.

Считали, что роль лакказы в деградации лигнина ограничивается только окислением концевых ароматических колец, содержащих свободные фенольные гидроксилы, которых в нативном лигнине содержится не более 10-20%. Образовавшиеся радикалы могут претерпевать дальнейшие превращения, включая диспропорционирование, полимеризацию, образование хинонов, арил-Сα – расщепление, окисление бензильного гидроксила, Сα-Сβ-разрыв или размыкание ароматических колец (рис.42).

Одной из характерных реакций феноксирадикала, образующегося за счет одноэлектронного переноса под действием лакказы является реакция полимеризации, протекающая по типу окислительного сочетания фенолов. Сшивка в молекуле полимера происходит за счет С₂, С₆ и преимущественно С₅ положений ароматического кольца, а так же с участием фенольного гидроксила с образованием С_ар-С и С_ар-О-С связей. От природы и положения заместителей в ароматическом кольце субстрата зависит направленность реакций. Конкуренция процессов поликонденсации и деструкции, вероятно, происходит до тех пор, пока в лигнине присутствуют свободные фенольные гидроксильные группы, после чего ее опережают процессы деструкции, сопровождающие разрывом С-С связей.

В зависимости от сроков культивирования микроорганизмов направленность реакций может изменяться или в сторону деструкции лигнина или в сторону его полимеризации.

 

 

Рис.42. Превращения радикалов, образующихся при воздействии культуральной жидкости Phanerochaete chrysosporium (по И.М. Грачевой и А.Ю.Кривовой, 2000)

 

 

Реакция полимеризации рассматривается обычно как способ детоксикации фенолов, образующихся при деградации лигнина. В присутствии пероксида водорода, радикал которого, вероятно, взаимодействует с фенокси-радикалом субстрата, лишая его способности к полимеризации, лакказа способна деполимеризировать лигнины. Следует отметить, что полимеризация может происходить и под действием лигнинпероксидазы в условиях in vitro. Это происходит и в тех случаях, когда подвергаются окислению субстраты со свободным фенольным гидроксилом.

Происходящая неэнзиматическая стабилизация радикалов зависит от таких факторов среды, как рН, концентрация кислорода, и т.д.:

Предполагают, что основные функции лакказы и Mn-пероксидазы заключаются в «выжигании» фенольных остатков в лигнине, что готовит субстрат для окисления различными изоформами лигнинпероксидазы.

Шимадой (1980) был предложен один из первых механизмов участия лакказ в биодеградации лигнина, который предполагал, что они могут участвовать в устранении ассиметричных центров в молекуле лигнина путем катализа не стериоспецифического окисления бензильных спиртовых групп с образованием кетонов (рис.43).

Рис.43. Механизм действия фенолоксидазы (по Shimada, 1980).

Дальнейшая деградация полимера могла происходить под действием ферментов, необходимых для разрушения стереоспецифических соединений нативного полимера.

В последнее время появились данные о непосредственном участии лакказ в деградации лигнина. При окислении лакказой гидрохинонов-производных лигнина например, 2-метокси-1,4-бензогидрохинон (MBQH₂) и 2,6-диметокси-1,4-бензогидрохинон (DBQH₂) - образуются семихиноны. Семихиноны претерпевают автоокисление до соответствующих хинонов, восстанавливая молекулу кислорода до супероксиданиона, который вступает в реакцию дисмутации с образованием свободного кислорода и перекиси: 2О^2-.+2Н⁺= О₂+Н₂О₂.

Данная реакция ускоряется супероксиддисмутазой. В присутствии ионов железа становятся возможными реакции образования ОН-радикала: О^2-.+Н₂О₂= О₂+ОН^-+ОН., где супероксид одноэлектронно восстанавливает перекись водорода до гидроксил-иона и гидроксил-радикала. Супероксиданион-радикал в присутствии ионов Mn²⁺ способен восстанавливаться до перекиси: О^2-.+Мn²⁺ + 2H⁺= H₂O₂+Mn³⁺.

Mn³⁺ может участвовать в неферментативных процессах, приводящих к разрушению нефенольных субструктур. В результате фермент может деградировать лигнин как косвенно, поставляя перекись водорода для лигнинпероксидаз и Mn-пероксидаз, так и непосредственно, генерируя окисленную форму ионов марганца.

В присутствии энхансеров или медиаторов возможно опосредованное окисление соединений. Энхансерами могут быть любые соединения, которые фермент окисляет непосредственно, образуя такие высоко реакционные частицы как радикалы или катион-радикалы. Эти частицы в дальнейшем могут действовать по-разному: а) непосредственно окислять вторичные субстраты как действует, например, катион-радикал вератрола; б) запускать цепь неферментативных процессов с участием кислорода, ионов металлов переменной валентности, анион-радикалов карбоновых кислот и т. п.

Семихиноны, являющиеся продуктами действия лакказ на замещенные гидрохиноны могут выступать в качестве медиаторов, запускающих каскад неферментативных реакций окисления и деградации нефенольных структур лигнина в отсутствие ферментов с более высоким редокс-потенциалом. В природе, очевидно, существует и механизм замыкания редокс-цикла с восстановлением образуемых хинонов обратно в гидрохиноны.

Фенольные субстраты лакказ, входящие в экстрактивные вещества древесины являются энхансерами способными усиливать действие фермента. Катион-радикальным медиатором, позволяющим лакказе окислять высокопотенциальные субстраты типа вератрола и нефенольных структур лигнина, предположительно за счет отрыва атома водорода от молекулы лигнина является АBTS(2,2′-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). В качестве посредников действия лакказы на высокопотенциальные субстраты способны выступать феноксазины и N-OH соединения. Медиаторы N-OH-типа окисляются подобно фенолам и их окисление протекает по схеме: сначала перенос электрона, а затем выброс протона. Системы окисления на основе лакказ и низкомолекулярных медиаторов в отличие от лигнинпнроксидазы и Mn-пероксидазы характеризуются отсутствием необходимости пероксида.

Цикл трансформвции лигнина и его мономеров тесно связан с циклом разложения целлюлозы. Среди промежуточных продуктов распада целлюлозы и лигнина обнаружены Н₂О, Н₂О_2, О₂, О^., целлобиоза, глюкоза, целлобионовая кислота, феноксильные радикалы. Через превращения глюкозы и целлобиозы эти циклы взаимодействуют.

Изучение биохимических превращений лигнина свидетельствует о том, что для проявления лигнолитической активности необходимым условием является продуцирование Н₂О₂. Важное место в генерации Н₂О₂ принадлежит глюкозооксидазе, пиранозо-2-оксидазе, метанолоксидазе, ацил-СоАоксидазе жирных кислот, арилалкогольоксидазе.

Грибы, продуцирующие лигнинразрушающие ферменты, условно подразделяют на четыре группы: 1) включает грибы (Trametes hirsutus, Phanerochaete chrysosporium, Phhellinus pini, Bjerkandera adusta), обладающие лигнинпероксидазной и Mn- пероксидазной активностями; 2) в эту группу входят грибы (Panus tigrinus, Daedaleopsis confragosa, Armillaria mellea, Dichomitus sgualens, Phanerochaete chrysosporium), продуцирующие Mn- пероксидазу и лакказу; 3) для данной группы грибов (Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus, Phlebia radiata) характерно наличие лигнинпероксидазы и лакказы, 4) у грибов четвертой группы (Pleurotus ostreatus, Bjerkandera adusta) обнаружены лакказа, арилалкогольоксидаза и другие оксидазы.

Пероксидгенерирующий фермент целлюбиозохиноноксидоредуктаза (целлобиозодегидрогеназа КФ1.1.99.18) играет важную роль во взаимной регуляции биохимических циклов разложения лигнина и целлюлозы (рис.44). Этот фермент обнаружен у многих грибов всех основных группах дереворазрушающих грибов, вызывающих мягкие, деструктивные и коррозионные гнили и представляет собой флавопротеин, имеющий в качестве простетической группы ФАД.

Целлобиозодегидрогеназа окисляет восстанавливающее звено подходящего ди- или олигосахарида до лактона, одновременно восстанавливая двух- или одноэлектронный акцептор. Акцепторами могут быть хиноны и феноксирадикалы, образуемые лакказами или неспецифическими пероксидазами, либо ионы трехвалентного железа или двухвалентной меди. Принципиально возможно также каталитическое восстановление кислорода до перекиси водорода, хотя он является плохим субстратом целлобиозодегидрогеназы.

 

Рис.44. Схема реакций, катализируемых целлобиозодегидрогеназой (целлобиозохиноноксидоредуктазой) и лакказой

 

Фермент высокоспецифичен по отношению к целлюбиозе и менее специфичен к хинонам. Он восстанавливает о- и п – хиноны в фенолы, предотвращает ингибирующее действие хинонов и полимеризацию хинонов, феноксирадикалов, образующихся при разложении лигнина.

Таким образом, биодеструкция лигнина и соединений, моделирующих его структуру лигнинразрушающими грибами, является окислительным процессом. Реакции окисления протекают с участием кислорода и пероксида водорода, необходимого для превращения лигнинпероксидазы в активное состояние. Под действием активированной пероксидом водорода лигнинпероксидазы катализируются реакции деструкции, за счет одноэлектронного переноса с субстрата на гем фермента происходит образование арильного катион-радикала. Фрагментация катион-радикала на катион и радикал является основным направлением его расщепления, хотя возможен и путь деструкции через депротонирование с образованием радикала, а потом α-кетона. Под действием лакказы могут происходить те же реакции с той лишь разницей, что лакказа способна окислять только фенольные соединения за счет образования феноксирадикала, благодаря взаимодействию гем - атома фермента с гидроксилсодержащим субстратом, а лигниназа еще и этерифицированные. Наряду с реакциями окислительной деструкции протекают реакции поликонденсации радикального типа, а так же реакция деметоксилирования. Каталитическая функция лигнинразрушающих ферментов находится в тесной взаимосвязи с целлюлазами, гемицеллюлазами, осуществляющими частичную деградацию углеводного комплекса с образованием глюкозы, при окислении которой генерируется пероксид водорода, необходимый для действия пероксидаз.