Дифференциальные признаки, особенности жизненного цикла и лабораторная диагностика токсоплазмоза, саркоцистоза, пневмоцистоза.

Диагностика токсоплазмоза, саркоцистоза, пневмоцистоза».

Цели занятия:

1. Сформировать представление о строении токсоплазм, понятие о различных методах диагностики токсоплазмоза.

2. Сформировать понятие о чередовании полового и бесполого (шизогония) размножения у споровиков, путях заражения, месте локализации, клинике заболеваний. Научить готовить мазки из разных материалов исследования, методике окраски мазков.

Исходный уровень знаний и навыков.

Учащийся должен знать:

1. Признаки строения токсоплазмы, цикл развития и пути заражения, бессимптомное и симптомное течение болезни.

2. Какой материал необходимо исследовать, проводение внутрикожной пробы, поставка биопробы на животных.

3. Клинику саркоцистоза, пневмоцистоза, пути заражения,

Учащийся должен уметь:

1. Работать с микроскопом с иммерсией готовых препаратов на выявление токсоплазм.

2. Различает саркоцист, пневмоцист, готовит мазки для исследования, красит мазки, работает с таблицами, оформляет работу.

Структура занятия:

Теоретическая часть:

Ø Микролекция.

Практическая часть:

Ø Изучение различных методов диагностики токсоплазмоза, саркоцистоза, пневмоцистоза.

Микролекция.

Диагностика токсоплазмоза.

Диагноз токсоплазмоза устанавливают на основании комплекса показателей, которые включают клинические данные и результаты лабораторного подтверждения. Относительное значение имеют эпидемиологические предпосылки, такие как контакт с кошками, условия общения с ними, особенности пищевых привычек (употребление сырого, полусырого мяса, проба сырого фарша, немытых овощей, фруктов), соблюдение личных гигиенических навыков, профессия и др.

Методы лабораторной диагностики токсоплазмоза делят на две группы: паразитологические и иммунологические.

Паразитологические методы диагностики токсоплазмоза основаны на возможности обнаружения возбудителя или выделении его при заражении восприимчивых животных - биопроба.

К ним относится прямая микроскопия мазков – приготовленных из тканей пораженных органов (миндалины, биоптат лимфоузлов, головного мозга, внутренние органы погибших эмбрионов или плодов) или мазков из осадка спинномозговой жидкости, крови, окрашенных по Романовскому - Гимзе. Можно исследовать гистологические препараты этих органов.

К сожалению, технические сложности обнаружения, а также редкие случаи обнаружения токсоплазм в крови, спинномозговой жидкости затрудняют использование этих методов.

Биологическая проба на белых мышах основан на внутрибрюшинном введении инвазионного материала белым мышам. Материал получают путем центрифугирования, при 2000-3000 об/мин в течение 10-15 мин, спинномозговой жидкости, крови, пунктата лимфатических узлов, околоплодной жидкости или взвеси трупного материала в 0,9 %-ном растворе NaCl. Полученный после центрифугирования осадок вводят внутрибрюшинно в объеме до 1 мл. За подопытными животными наблюдают 10-12 дней. В положительных случаях у мышей развивается острая форма токсоплазмоза. Паразиты выявляются вперитониальном экссудате мышей, в меньшей степени - в печени, селезенке, легких.

Но заключение, что в данном препарате обнаружены токсоплазмы, не несёт никакой положительной информации, за исключением той, что данный пациент был ими инфицирован. Также и отсутствие в препарате возбудителя не может служить основанием для исключения токсоплазмоза, поскольку в исследуемый материал он мог просто не попасть.

В широкой практике используют преимущественно иммунологические методы диагностики токсоплазмоза, которые включают серологические реакции и внутрикожную пробу. Эти методы, достаточно специфичные и чувствительные.

Из методов серологической диагностики токсоплазмоза используют реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА). Диагноз подтверждается достоверным нарастанием титра антител - динамикой титров в парных сыворотках, взятых с интервалом 2-4 недели.

РСК становится положительной со 2-й недели после заражения и наибольших титров - 1:16 - 1:320 достигает через 2-4 месяца. Через 1-3 года может стать отрицательной или сохраниться в низких титрах (1:5, 1:10), которые не имеют самостоятельного значения.

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

РНИФ становится положительной с 1-й недели инфекции и максимальных показателей (1:1280 - 1:5000) достигает на 2- 4 месяце. В низких титрах 1:10 - 1: 40 может сохраняться 15-20 лет.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

ИФА в соответствии с ориентацией на международный стандарт ВОЗ является наиболее объективным методом. О положительной реакции свидетельствуют оптические показатели более 1,5, в иммуноферметных единицах - больше 60, в международных - больше 125, в титрах антител - 1:1600 и больше.

Иммуноферментный анализ или метод – выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат-хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

В крови выявляются определенные типы антител: IgM и IgG. IgM появляются в организме примерно через 2 недели после заражения токсоплазмой, их количество постепенно достигает пика, а затем снижается до нуля примерно к 8-10 неделе после заражения. Наличие в крови IgM указывает на то, что это острая инфекция, то есть в настоящее время человек болен токсоплазмозом.

Обнаружение в крови IgG наоборот, говорит о том, что организм встречался с инфекцией раньше, но уже победил ее. Если в крови были обнаружены и IgM и IgG, это означает, что заражение произошло в течение последних 12 месяцев.

Аллергологический метод – основан на введение внутрикожно антигенного комплекса, полученного из перитонеального экссудата белых мышей, зараженных Toxoplasma gondii. Специфическая безвредность препарата определяется отсутствием в нем жизнеспособных форм паразита.

Внутрикожная проба проводится путем введения в кожу ладонной поверхности предплечья или наружной поверхности плеча аллергена токсоплазмина. Аллерген в количестве 0,1 мл инсулиновым шприцом вводят внутрикожно, а на расстоянии 5-7 см от места введения ал­лергена в качестве контроля вводят 0,1 мл 0,9 %-ного NaCl. Учет реакции производится через 24-48 ч. Различа­ют резкоположительную реакцию (++++) при диаметре инфильтрата более 20 мм, положительную (+++) - при инфильтрате 15-20 мм в диаметре, слабоположительную (++) - при инфильтрате 10-15мм и отрицательную (+) -' при инфильтрате менее 10 мм или его отсутствии. Быстро возникающие реакции и исчезающие спустя 40-48ч счи­таются неспецифическими. Внутрикожная проба специ­фична, но по ней нельзя судить об активности процесса вследствие ее длительного сохранения.

Диагностика саркоцистоза.

Диагностика кишечного саркоцистоза: в свежевыделенных испражнениях обнаруживают одиночные или реже спаренные спороцисты, содержащие по 4 зрелых спорозоита. Спороцисты появляются в фекалиях с 9-го дня после заражения, максимальное их число наблюдается на 14—22-й день, и могут обнаруживаться сравнительно недолго и в небольшом количестве. Рекомендуется применять методы обогащением – флотация в 33 % растворе сульфата цинка (см. практич. работу №3).

Для диагностики мышечного саркоцистоза проводится биопсия и исследуются мазки и гистологические срезы очагов поражения. Применяют также методы переваривания мышц с трипсином или микроскопии мышц в компрессориуме с помощью трихинеллоскопа. Для исследования берут мышцы пищевода, сердца, диафрагмы, где саркоцисты локализуются наиболее часто. Перед микроскопией рекомендуют на мышечные срезы нанести но 2—3 капли смеси из равных частей 0,5 % водного раствора метиленового синего и ледяной уксусной кислоты. После 3—5-минутного окрашивания срезы обесцвечиваются, нанося на них 2—3 капли 20—25 % раствора нашатырного спирта. На голубом фоне мышечной ткани саркоцисты имеют темно-синий цвет.

Переваривание мышц с трипсином Фрагмент мышцы измельчают, переносят в коническую колбу соответствующей вместимости и заливают ИЖС в соотношении 1:15. Колбу помещают в термостат при температуре 41 - 42 °С и выдерживают 5 - 7 ч, периодически перемешивая. За 10 мин. до окончания переваривания перемешивание прекращают. После окончания переваривания в осадке остаются хлопья коричневого или темно-коричневого цвета.

Из колбы сливают (осторожно) 2/3 надосадочной жидкости, осадок выливают на сито, установленное в стеклянной воронке, соединенной резиновой трубкой с пробиркой вместимостью 5,0 мл.

Залитый осадок отстаивают 15 - 20 мин., затем резиновую трубку перекрывают зажимом и пробирку отсоединяют. Содержимое пробирки (осадок) переносят по частям на предметное стекло и исследуют под малым (8x10) увеличением микроскопа или трихинеллоскопа на наличие саркоцист.

Микроскопия мышц в компрессориуме: из кусочков мышц изогнутыми ножницами по ходу мышечных волокон делают 24 среза величиной с овсяное зерно, которые помещают в середину клеточки компрессориума, накрывают вторым стеклом и завинчивают винты, раздавливая срезы так, чтобы они стали прозрачными и удобными для их качественного просмотра.

Срезы исследуют под малым увеличением (8x10).

При просмотре срезов обнаруживают саркоцисты, которые имеют собственную оболочку цилиндрической или неправильной формы; циста состоит из камер, внутри которых находятся мерозоиты.

Диагностика пневмоцистоза.

Для обнаружения пневмоцист микроскопируют окрашенные по Романовскому мазки слизи, полученной у детей методом прямой ларингоскопии, катетером — из трахеи или верхних дыхательных путей. Исследуют также окрашенные мазки мокроты или слизи из нижних отделов дыхательных путей, полученных при глубоком откашливании, лучше после предварительной ингаляции водяного пара.

Пневмоцисты могут быть обнаружены не ранее 2-й недели болезни. Прямое микроскопирование мазков не всегда дает положительный результат, так как типичные восьмиядерные цисты обнаруживаются сравнительно редко, а отдельные вегетативные особи не всегда могут быть различимы в препарате, где обычно наблюдается обилие различных клеток и их остатков.

При летальном исходе изучают гистологические срезы и мазки - отпечатки легких. Разработаны серологические методы диагностики пневмоцистоза.

Практическая часть

Дифференциальные признаки, особенности жизненного цикла и лабораторная диагностика токсоплазмоза, саркоцистоза, пневмоцистоза.

Признаки	Токсоплазма	Саркоцисты	Пневмоцисты
Размеры ооцист, мкм
Форма ооцист
Способ размножения
Звенья эпид. цепи
Локализация в организме человека
Особенности жизненного цикла (смена хозяина)
Лабораторная диагностика
Исследуемый материал
Методы диагностики
Профилактика