Специальные методы микроскопии.

Темнопольный микроскоп – применяется для изучения прозрачных, слабо преломляющих свет объектов, не видимых при освещении обычным способом. Для создания темнопольного освещения используются специальные конденсоры темного поля. Принцип освещения заключается в том, что лучи направляются на объект, не допуская попадания прямых лучей в объектив. Исследователь наблюдает светящиеся части изображения на темном фоне. Пределом возможностей такого способа микроскопирования является определение частиц до 2 нм. Существенный недостаток – невозможность определить форму и внутреннее строение наблюдаемых частиц.

Фазово – котрастный микроскоп – применяется для изучения малоконтрастных прозрачных (в частности, живых или неокрашенных) объектов, которые почти не поглощают света, т.е. не изменяют амплитуду световой волны, но изменяют фазу проходящей волны. Однако глаз не может регистрировать фазовых изменений. С помощью специального конденсора и объектива они искусственно превращаются в амплитудные, восприни-маемые глазом. В результате этого создается контрастное, четкое изображение неокрашенных структур.

Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количест-венного определения массы ткани, и дифференциальный интерферен-ционный микроскоп (с оптикой Номарского), который специально используется для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется эффект интерференции, возникающий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной и интерференционной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки.

Поляризационный микроскоп – выявляет в гистологических объектах изо- и анизоструктуры (одинарное и двойное лучепреломление в биологических объектах). Для получения поляризованного луча используют, в частности, призму Николя, помещаемую между источником света и объектом. Другая призма – анализатор находится во вращающейся обойме между объективом и окуляром. При повороте призмы анализатора на 90 градусов в поле зрения остаются видимыми только анизотропные структуры. Методом исключения определяются изотропные структуры, которые видны при нулевом положении призмы. Изображение препарата рассматривается через окуляр.

Ультрафиолетовый микроскоп – дает возможность уменьшить разрешаемое расстояние до 0,1 мкм вследствие применения ультрафиолетовых лучей. В качестве источника используют ртутно-кварцевые лампы. Вся оптика микроскопа, а также покровные и предметные стекла готовятся из кварца. В основе ультрафиолетовой микроскопии лежит избирательное поглощение биологическими тканями и клетками коротковолнового излучения, вследствие чего микроскопирование ультрафиолетовых изображений позволяет увидеть их структуру. Полученное в ультрафиолетовых лучах, не видимое глазом изображение, преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

Люминесцентный (флюоресцентный) микроскоп – используется для изучения распределения ряда химических компонентов в гистологических структурах. Основой для создания этого прибора послужило явление люминесценции, т.е. возбужденного свечения некоторых биологически важных соединений. Любая клетка живого организма обладает флюоресценцией, однако она обычно бывает чрезвычайно слабой. Наведенная (искусственная) люминесценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – люминофорами (акридиновый оранжевый). Их концентрация настолько мала, что они не влияют на состав и структуру препарата, а также не нарушают жизнедеятельность биологических объектов. Это дает возможность проводить витальные наблюдения. Соответственно основ преимуществом метода флюоресцентной микроскопии является возможность наблюдений цитологических объеков, в том числе и проведения на живом не фиксированном материале некоторых цито- и гистохимических реакций, причем в этом применении метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Электронный микроскоп -даетвозможность получить изображение объектов, величина которых в среднем имеет около 0,1-0,7 нм. Столь высокая разрешающая способность объясняется применением электронных лучей. Источником электронов является электронная лампа без оболочки. Вольфрамовая нить катода под влиянием нагрева излучает поток электронов, который направляется в тубус. В условиях вакуума электронные лучи в магнитном поле ведут себя подобно лучам видимого света в стеклянной призме. Поэтому электромагниты электронного микроскопа называют линзами. Различают конденсорную, объективную и проекционную линзы. Между конденсором и объективом помещают объект. Электронный пучок сначала фокусируется конденсорной магнитной линзой. Большая часть электронов, проходя через объект, фокусируется второй магнитной линзой – объективной, которая дает увеличенное изображение объекта. Это изображение увеличивается третьей магнитной линзой – проекционной. Электроны, которые проходят через объект, вызывают свечение экрана, покрытого люминофором, производя на нем изображение объекта, т.е.

изображение получается на люминесцирующем экране. Его фотографируют и, таким образом, предметом изучения является электронная микрофото-графия. С помощью электронного микроскопа стало возможным изучение ультраструктуры клеток и их производных, макромолекул, вирусов и др. субмикроскопических образований.

В настоящее время существуют два типа электронных микроскопов:

- растровый электроныый микроскоп,

- просвечивающий электронный микроскоп.

Так называемые растровые (сканирующие) электронные микроскопы позволяют получить объемное изображение изучаемых объектов. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т.е. последовательно «ощупывать» сфокусированным электронным лучом отдельные точки поверхности.

Главным достоинством растровой электронной микроскопии является большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения и высокая разрешающая способность.

Просвечивающий электронный микроскоп позволяет получить плоское изображение исследуемого объекта.

Микрометр - используется для измерения линейных размеров микроскопических объектов.

Контрольные вопросы

1. Механические части микроскопа: устройство, назначение.

2. Оптические части микроскопа: устройство, назначение.

3. Осветительный аппарат микроскопа: назначение зеркала и конденсора.

4. Основные свойства линз микроскопа. Виды аберраций.

5. Виды объективов и окуляров, их особенности.

6. Определение увеличения и разрешающей способности микроскопа.

7. Основные правила микроскопирования гистологических препаратов.

8. Принцип действия и назначение ультрафиолетового, люминесцентного, и электронного микроскопов.

 

Вопросы, вынесенные на СРС

1. Принцип действия и назначение фазово-контрастной, интерференционной, поляризационной, темнопольной микроскопии.

2. Техника измерения микроскопических объектов.