ТЕМА: Хроматографічне розділення суміші вітамінів. Кількісне визначення вітамінів.

Дослід 13.1 Розділення суміші водорозчинних вітамінів на пластинках Silufol

Принцип методу. Метод базується на здатності рідинної фази рухатися по шару адсорбента й за рахунок капілярної сили переміщувати з різними швидкостями компоненти суміші, яку розділяють. Положення плям речовин на хроматограммі характеризує значення Rf.

Матеріали та реактиви. Суміш вітамінів (тіамін, піридоксол, аскорбінова кислота, рибофлавин, нікотинова кислота) готується в 50% етанолі, розчинник №1 - бензол -метанол - оцтова кислота - ацетон (20: 20: 5: 5), розчинник №2 - бензол -метанол - оцтова кислота-ацетон (55: 35: 5: 5), пластинка Si1ufo1.

Обладнання. Мікропіпетки, джерело УФ-променів, камера для хромотографії.

Таблиця Rf водорозчинних вітамінів

Речовина	Розчинник №1	Розчинник №2
Тіамін	0,00	0,00
Піридоксол	0,17	0,60
Аскорбінова кислота	0,48	0,16
Рибофлавін	0,53	0,22
Нікотинова кислота	0,68	0,44

Хід роботи.

В кутку пластинки Silufol на відстані 2 см від кожного боку наносять розчин суміші вітамінів по 5 мкл, 3 мкг/мкл розчину тіаміну, аскорбінової та нікотинової кислот, 10 мкл 3 мкг\мкл розчину піридоксолу. Використовують двомірне розділення; для першого напрямку використовують розчинник №1. Потім пластинку пудсушують і проводять розділення в перпендікулярному напрямку в розчиннику №2. Потім пластинки висушують і виявляють плями вітамінів в ультрафіолетових променях, використовуючи значення Rf вітамінів для розчинників №1 і №2 (табл.)

Дослід 13.2 Кількісне визначення вітаміну Є.

Принцип методу. Під час взаємодії спиртового розчину α-токофсролу з концентрованою азотною кислотою суміш забарвлюється в червоний колір, інтенсивність якого пропорційна концентрації вітаміну Є й може бути визначена за допомогою фотоелектроколориметра.

Матеріали та реактиви. Спиртовий (0,1%) розчин вітаміну Є, 70% розчин азотної кислоти, абсолютний етиловий спирт.

Обладнання. Штатив із пробірками, колби, піпетки, водяна баня,

фотоелектроколориметр.

Хід роботи.

В дві пробірки наливають по 2,5 мл спиртового розчину вітаміну Є, додають по 0,5 мл розчину азотної кислоти й ставлять у киплячу водяну баню на 3 хв. Потім пробірки охолоджують і залишають у темному місці на 15 хв. Об'єм рідини в кожній пробірці доводять абсолютним еталоном до 5 мл, перемішують і фотометрують за λ 470 нм (синій світлофільтр). Концентрацію вітаміну Є в дослідному розчині визначають за калібрувальним графіком, де кожному значенню знайденої екстинкції відповідає певний вміст вітаміну Є в 1 мл розчину. Для побудови калібрувального графіка використовують спиртовий препарат, який містить в 1 мл 100 мг α-токоферолу. З цією метою 0,5 мл такого препарату розчинюють абсолютним еталоном у колбі об’ємом 50 мл (у 1 мл міститься 1 мг препарату). У чотири пробірки наливають по 0.5, 1.0, 1.5, 2,0 мл цього розчину й доводять загальний об’єм рідини абсолютним еталоном до 2.5 мл в кожній пробірці. За значенням оптичної густини розчинів, які мають різну кількість вітаміну Є, будують калібрувальний графік. На осі ординат відкладають екстинкції, на осі абсцис- відповідні концентрації вітаміну Є в 1 мл.

Дослід 13.3 Кількісне визначення вітаміну С.

Хід роботи.

Наважку порошку розтертого драже або таблеток, покритих оболонкою, з вмістом біля 0.1 г кислоти аскорбінової переносять водою у мірну колбу на 100 мл, доводять об’єм розчину до мітки, перемішують і фільтрують; перші 10 мл відкидають, 10 мл розчину вмішують в конічну колбу вмістимістю 100 мл, додають 1 мл 2% розчину хлористоводородної кислоти, 0.5 мл 1% розчину калія йодіда, 2 мл 0.5% розчину крохмалю, води до об’єма 20 мл і титрують розчином калія йодата (0.00167 моль\л) до появи стійкого світло-синього кольору.

Паралельно проводять контрольний дослід. Для цього в конічну колбу

вміщують 1 мл 2% розчину хлористоводородної кислоти, 0.5 мл 1% калія йодіда, 2мл 0.5% крохмалю, води до об’єму 20 мл і титрують розчином калія йодата (0.00167 моль\л) до появи стійкого світло-синього забарвлення.

1 мл розчину калія йодата (0.00167 моль\л) відповідає 0.0008806 г С₆Н₈O₆ (кислоти аскорбінової).

Питання і вправи

До теоретичної частини:

1. Які вітаміни відносяться до водорозчинних?

2. Яка структурна формула тіаміну? Яка його роль у діяльності організмів? Де цей вітамін знаходиться у природі?

3. Напішить структурні формули вітамінів групи В? Яка роль кожного з цих вітамінів?

4. Який з вітамінів групи В необхідний для життєдіяльності дріжджів і молочнокислих бактерій?

5. Який з вітамінів стійкий до дії кислот і лугів, але дуже чутливий до окисників і світла?

6. Яка будова вітаміну Н? Як цей вітамін відноситься до дії високих температур, кислот і лугів?

7. Яка роль вітаміну Н?

8. Які компоненти фолієвої кислоти?

9. Наведіть структурну формулу вітаміну С? Де знаходиться цей вітамін? Яка біологічна роль аскорбінової кислоти?

10. Які вітаміни відносяться до жиророзчинних?

11.Як відноситься до температури,окисників, кислот вітамін А?

12. Яка роль вітаміну А у житті людини?

13.Яка хімічна формула вітаміну Д? Джерела вітаміну Д? Яка його роль?

14.Які речовини відносять до вітаміноподобних? Яка роль цих речовин?

До експерементальної частини:

1. Як провести кількісне визначення вітаміну Р у чаї?

2. Як проводять кількісне визначення вітаміна С у овочах?

3. Яким методом проводять визначення вітаміну А у риб’ячому жирі?

4. Як проводять якісне та кількісне визначення вітаміну Є?