Количественное определение белка

 

ПРИНЦИП МЕТОДА:

Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) NaCl, 0,9 %; 2) биуретовый реактив: 0,15 г CuSO₄ · 5H₂O и 0,6 г NaKC₄H₄O₆ · 4H₂O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ого раствора NaOH (свободного от Na₂CO₃), добавляют 0,1 г KI и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке; 3) стандартный раствор альбумина (БСА – бычий сывороточный альбумин), 10 мг белка в 1 мл; 4) раствор сыворотки с разведением в 10 раз: взять 1 мл сыворотки крови довести дистиллированной водой или 0,9 % раствором NaCl до объема 10 мл. Полученная концентрация белка будет соответствовать 6,5-8,5 г/л; 5) пробирки, пипетки; 6) ФЭК.

ХОД РАБОТЫ:

1. Опытная проба: к 4 мл биуретового реактива добавляют, избегая образования пены, 1 мл приготовленного раствора сыворотки крови с 10-ти кратным разведением.

2. Контрольная проба: к 1 мл раствора хлорида натрия приливают 4 мл биуретового реактива.

Пробы делают в 2-х повторениях!

Через 45-50 мин опытную пробу колориметрируют на ФЭКе при длине волны 540 нм против контрольной пробы (либо против дистиллированной воды).

3. Расчет ведут по калибровочной кривой. Данные для построения калибровочного графика приведены в таблице 4.

Таблица 4

Данные для построения калибровочного графика

№ пробы	Рабочий р-р биуретового реактива (мл)	Стандартный р-р белка (мл)	0,9 % р-р NaCl или дист Н2О (мл)	Содержание белка в пробе (г)	Концентрация белка (г/л)
1.		0,2	0,8	0,002	2,0
2.		0,4	0,6	0,004	4,0
3.		0,6	0,4	0,006	6,0
4.		0,8	0,2	0,008	8,0
5.		1,0		0,010	10,0

 

При построении калибровочной кривой серию стандартных растворов обрабатывают так же, как и опытные пробы. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭКе при 540 нм против дистиллированной воды.

Измерения оптической плотности стандартных растворов начинают с растворов наименьшей концентрации.

Пробы делают в 2-х повторениях!

По результатам измерений строится калибровочная кривая. Средние значения оптической плотности (А) 2-х повторений (соответствующие различным концентрациям) наносят на миллиметровую бумагу на оси ординат, на оси абсцисс откладывают значения концентрации стандартных растворов белка (С).

Полученную по графику концентрацию белка в исследуемой опытной пробе умножают на величину разведения (х10).

Значения концентрации общего белка в сыворотке крови практически здоровых людей составляет 65-85 г/л.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

 

Опишите физико-химическую характеристику пептидной связи. Почему пептидные связи являются основой строения белка?

Как определить количество вещества с использованием калибровочной кривой?

Какова концентрация общего белка в сыворотке крови здорового человека?

 

Тема 4

ГИДРОЛИЗ БЕЛКА. ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ

 

Гидролиз – распад сложного вещества на более простые составные части, связанный с присоединением воды по месту разрыва связей. В зависимости от применяемого катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются только аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе, как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.

При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин – частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов.

 

Лабораторная работа №9