Методы Экспериментального Изучения опухолей

 

Существует несколько методов изучения опухолевого роста в эксперименте: трансплантация, индукция, а также использование линейных животных с повышенной частотой развития опухолей и генетически модифицированных животных.

Трансплантация опухоли. Впервые успешная трансплантация опухоли от взрослой собаки щенку была произведена отечественным ученым Н.М. Новинским в 1876 году. Метод трансплантации опухоли достаточно прост в воспроизведении, хотя требует соблюдения определенных правил.

· Опухоль практически не перевивается от одного вида животного к другому, слишком сильные видоспецифические антигены вызывают мощную иммунную реакцию и уничтожение опухолевых клеток.

· Животное, которому перевивается опухоль, должно иметь высокую степень реактивности, поскольку в канцерогенезе имеет значение не только влияние опухолевой клетки на окружающие ткани, но и реакция организма на эту клетку, наличие субстратов для адгезии, роста опухолевой ткани. Обычно этим требованиям отвечают молодые животные.

· Количество перевиваемой опухолевой ткани должно быть достаточно большим, т.к. одна или несколько опухолевых клеток будут уничтожены иммунной системой хозяина.

В последние годы в исследованиях все чаще используют ксенотрансплантацию, т.е. перевивку опухолей человека на животных. Для предотвращения иммунной деструкции трансплантированных клеток для ксенотрансплантации чаще всего используют мышей с выраженным иммунодефицитом, например, атимических безволосых мышей. Выделяют два варианта ксенотрансплантации опухолевой ткани: 1) ортотопическую, при которой фрагмент опухоли человека помещают в тот же орган мыши-реципиента, из которого произошла опухоль пациента, и 2) гетеротопическую, при которой опухолевую ткань трансплантируют подкожно.

К преимуществам использования модели ксенотрансплантации относятся:

· Возможность анализа опухолевой ткани человека, характеризующейся высокой степенью генотипической и фенотипической гетерогенности;

· Возможность персонализированного подбора противоопухолевой терапии;

· Результат относительно устойчивости опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам может быть получен в течение всего нескольких недель от момента получения биопсийного материала у пациента.

Относительным недостатком классической модели ксенотрансплантации является наличие глубокого дефекта иммунной системы реципиента. Для решения этой проблемы предложено использовать для ксенотрансплантации атимических мышей, которым предварительно были введены гемопоэтические стволовые клетки человека. Эта процедура, называемая "гуманизацией", позволяет частично восстановить иммунный ответ у животного-реципиента.

Трансплантация опухоли является удобным методом для оценки опухолевой прогрессии, изучения влияния опухоли на организм, и особенно исследования методов лечения опухоли, подборе химиопрепаратов против конкретных видов опухолей.

Индукция опухолей. Данный метод предполагает воздействие на организм животного различными канцерогенными факторами с целью возникновения опухолей. Чаще используют вирусный и химический канцерогенез.

В 1908 году Ellermann и Bang первыми воспроизвели перевивку опухоли (лейкоза) в опытах на птицах с помощью бесклеточного фильтрата, что можно считать первой демонстрацией роли вирусов в канцерогенезе. Затем, аналогичные опыты в 1911 году были выполнены Rous, который путем введения бесклеточного фильтрата куриной саркомы индуцировал развитие этой же опухоли у здоровых птиц. Впоследствии была доказана вирусная природа этих опухолей. Вирус-индуцированные опухоли у лабораторных животных - явление очень частое. Существует множество вирусов, вызывающих опухоли различных локализаций у мышей, хомячков, крыс и т.д. Онкогенные вирусы представлены как ДНК-, так и РНК-содержащими вирусами. У животных опухоли вызываются преимущественно РНК-содержащими вирусами. Существуют линии животных с опухолями, возникающими вследствие зараженности онкогенными вирусами (вирусом рака молочной железы, вирусом лейкоза мышей и т.д.). Хорошо известен так называемый фактор молока Биттнера (онковирус), названный так в честь автора блестящей работы (Bittner, 1936), доказавшего возможность передачи рака молочной железы от мышей высокораковой линии новорожденным мышатам низкораковой линии через материнское молоко.

Индукция опухоли с помощью химических канцерогенов достаточно сложна в исполнении и нередко требует проведения длительного эксперимента. Так, первый удачный опыт по индукции опухоли химическим веществом был выполнен в 1915 году, когда японские исследователи Ямагива и Ишикава сумели вызвать развитие опухоли кожи на ухе кролика после 6-месячного втирания в нее каменноугольной смолы. В экспериментах на животных подтверждается прямой канцерогенный эффект некоторых веществ. Однократная подкожная инъекция бензпирена и других ПАУ в зависимости от дозы после длительного латентного периода (3-4 месяца) приводит к развитию саркомы преимущественно в месте введения. Многократное введение ПАУ приводит к развитию лейкозов, а также опухолей различной локализации с меньшим латентным периодом. Выраженным канцерогенным действием в экспериментальной практике обладают производные нитрозомочевины, вызывая у грызунов (крысы, мыши, морские свинки) опухоли печени, пищевода, желудка, поджелудочной железы.

В настоящее время любые химические вещества, с которыми контактирует человек, а особенно фармакологические препараты, должны испытываться на животных для оценки степени их канцерогенности.

Линейные животные с повышенной частотой развития опухолей. Большое значение в экспериментальной онкологииимеют линейные (инбредные) животные, полученные путем близкородственного скрещивания на протяжении многих поколений. Определенные линии таких животных имеют высокую частоту развития опухолей определенных локализаций, что обычно определяется полигенным наследованием. В качестве примера можно привести самок крыс линии BDII, у которых в 100% случаев развиваются аденокарциномы матки, или самцов линии Lobund-Wistar, c такой же частотой подверженных раку предстательной железы. У самцов мышей линии СВА с высокой частотой развиваются гепатокарциномы, тогда как у самок они выявляются в единичных случаях.

Модели опухолевого роста у генетически модифицированных животных. В последнее время широкое распространение во всем мире получили модели опухолевого роста с использованием генетически модифицированных мышей. Первое поколение таких моделей включало два варианта генетической модификации животных: 1) перманентное удаление (нокаутирование) одного или нескольких антионкогенов (например, Rb, Brca1, PTEN, p53 и др.) и 2) введение в геном дополнительных копий онкогенов (трансгенез, например, c-Myc). Однако, такие модели имели ряд недостатков:

· Высокая летальность животных на стадии эмбриона, существенные дефекты развития и стерильность взрослых особей;

· Усиление экспрессии (или удаление) гена во всех клетках организма не отражает реальной ситуации, когда измененные клетки окружены здоровыми клетками;

· В случае трансгенеза затруднен контроль над локализацией введенного гена и количеством его копий;

· Наличие выраженных компенсаторных изменений, влияющих на итоговый фенотип.

В связи с этим в последние годы разработаны усовершенствованные генетические модели опухолей у мышей. Так, например, технология Cre-Lox позволяет обеспечить высокоспецифическое «выключение» антионкогена в определенном органе или ткани в результате воздействия определенного внешнего физического фактора (например, излучения определенной длины волны). Такие животные получили название кондиционных нокаутов. Выключение функции гена при этом осуществляется необратимо в результате активизации внешним фактором рекомбиназы Cre, обеспечивающей исключение из генома гена-мишени, с двух сторон "промаркированного" loxP последовательностями. В то же время, конечной целью моделирования опухолей у генетически измененных животных является возможность обратимого «включения/выключения» любых генов, задействованных в развитии опухоли, в любой ткани и на любой стадии онтогенеза. Частично данную проблему решают тетрациклин-чувствительные генетические конструкции, позволяющие осуществлять обратимое ингибирование экспрессии определенного гена.

 

Рекомендуемая литература

 

1. Анисимов В.Н. Современные подходы к изучению канцерогенной безопасности, противоопухолевой, антиканцерогенной и геропротекторной активности фармакологических препаратов / В.Н. Анисимов и соавт. // Вопросы онкологии. - 2012. - Т. 58, №1. - С. 7-18.

2. Аничков Н.М. Биология опухолевого роста (молекулярно-медицинские аспекты) / Н.М. Аничков, И.М. Кветной, С.С. Коновалов. - М.: Олма-Пресс, 2004. - 216 с.

3. Имянитов Е.Н. Молекулярные механизмы опухолевого роста / Е.Н. Имянитов // Вопросы онкологии. - 2010. - Т. 56, № 2. - С. 117-128.

4. Pecorino L. Molecular biology of cancer. Mechanisms, targets, and therapeutics / L. Pecorino. - 3rd edition. - Oxford Press, 2012. - 360 p.

5. Weinberg R.A. The biology of cancer / R.A. Weinberg. - 2nd edition. - Garland Science, 2013. - 960 p.