Механізм спряження дихання та фосфорилування в мітохондріях

Існування поєднання перенесення електронів і окиснювапьного фосфорилування було відкрито у 30-их роках ХХ ст. російським вченим В.А.Енгельгардтом. Вивчаючи інтенсивність дихання мітохондрій голуба, він помітив, що одночасно з поглинанням кисню в цьому процесі використовується неорганічний фосфат з утворенням фосфорних ефірів, тобто має місце спряження дихання з фосфорилуванням.

У 1939 році українськими вченими В. Беліцером і Е.Цибаковою було виведено співвідношення Р/О як показник спряження дихання і фосфорилування. В. Беліцер показав, що при поглинанні одного атома кисню (або при перенесенні однієї пари електронів від субстрату на кисень) поглинається три атоми неорганічного фосфату: коефіцієнт Р/О дорівнює приблизно 3, тобто в дихальному ланцюзі є три пункти спряження або фосфорилування, де неорганічний фосфат приймає участь в утворенні АТФ.

Існує декілька гіпотез пояснення механізму цього процесу. Основні – це гіпотеза хімічного спряження, хеміосмотичного і механохімічного спряження або конформаційного спряження. У даний час найбільше обгрунтування отримала теорія хеміосмотичного спряження, розроблена англійським біохіміком П. Мітчеллом.

Більшість ферментів дихального ланцюга закріплені досить міцно у ліпідно-білковій структурі мембрани. Перша ланка дихального ланцюга пов‘язана з НАД-або ФАД-залежними дегідрогеназами, знаходиться на внутрішньому боці мембрани.

Як видно зі схеми, представленої на рис. 3.7 перше акцептування починається на ділянці від НАДН₂ до КоQ (убіхінону). Отже, саме тут вивільняється перша пара протонів, а два електрони транспортуються з участю заліза до КоQ, який приєднує електрони і отримує від’ємний заряд та одночасно захоплюються протони з матриксу мітохондрій, що супроводжується утворенням КоQН₂ і появою від’ємного заряду на внутрішній поверхні мембрани.

Друге акцептування протонів спостерігається при перенесенні електронів на ділянці від КоQН₂ до цитохрому с₁. Відновлений КоQН₂ дифундує через мембрану до зовнішньої поверхні, де розміщений цитохром с₁ і залізосірчаний білок. На внутрішній поверхні мембрани окиснення супроводжується переходом другої пари іонів 2Н⁺ в середовище і повернення двох електронів на залізосірчаний білок, а потім до другої молекули КоQ, при цьому він дістає від’ємний заряд і захоплює ще два протони з матриксу (рис.3.8).

 

Третє акцептування відбувається, коли КоQН₂ з участю цитохромів с₁ і с передає електрони на цитохромоксидазу (аа₃). На цитохромоксидазі, у якої активний центр повернений до матриксу, відбувається передача електронів на молекулярний кисень. Іони водню (Н⁺) для утворення молекул води поступають із матриксу мітохондрій.

Ліпідрозчинний кофермент Q (убіхінон), що легко дифундує з внутрішнього боку мембрани (від матрикса) до зовнішнього, виступає також перенощиком протонів із матриксу на зовнішню поверхню мембрани – у міжмембранний простір. Вважають, що енергія, яка виділяється при перенесенні їх в дихальному ланцюзі, перекачує протони із матриксу в міжмембранний простір, обминаючи їх нагромадження всередині самої мембрани. При цьому створюється так званий протонний потенціал (різниця концентрацій Н⁺ по обидва боки внутрішньої мембрани), а, отже, і електрохімічний потенціал (зарядженість), який використовується в процесах фосфорилування АДФ при утворенні АТФ. Тому внутрішня мембрана в мітохондрій непроникна для заряджених частинок і особливо для Н⁺ і ОН^- Якщо б мембрана була проникною для іонів Н⁺, вони повернулися б назад, у напрямку їх меншої концентрації в матрикс. Енергія при цьому повинна виділятись у вигляді тепла. Це підтверджується і тим, що при додаванні деяких речовин, так званих “роз’єднуючих агентів” різко збільшується проникність внутрішньої мембрани для протонів, відбувається роз’єднання процесів тканинного дихання й окиснювального фосфорилування і утворення АТФ припиняється.

Прикладом цього може служити дія 2,4-динітрофенолу (рис.3.9). Ця ліпофільна речовина легко дифундує через мітохондріальну мембрану, як в іонізованій, так і в неіонізованій формах, виступаючи джерелом протонів. Може переносити протони через мембрану в бік меншої концентрації, що призводить до зниження протонного потенціалу. У присутності роз’єднувачів (в тому числі і природних, наприклад тироксину), а також деяких лікарських засобів (аспірин, дикумарол тощо) вільна енергія, яка виділяється при перенесенні електронів, переходить в теплову. Використання кисню і окиснення субстратів при цьому продовжується, але синтез АТФ неможливий. Оскільки енергія окиснення при цьому розсіюється у вигляді тепла, то роз’єднувачі підвищують температуру тіла (пірогенна дія).

Всі вищевказані та інші факти мали значення для створення хеміосмотичної концепції спряження тканинного дихання з фосфорилуванням.

На думку П. Мітчелла енергія перенесення протонів і електронів у дихальному ланцюзі в першу чергу зосереджується у вигляді протонного потенціалу або електрохімічного градієнта іонів Н⁺, який створюється перекачуванням протонів через мембрану (по певних пунктах дихального ланцюга) з внутрішньої поверхні внутрішньої мембрани (з боку матриксу) на її зовнішню поверхню - в міжмембранний простір.

Одночасно поверхні мембрани заряджаються: зовнішня – позитивно, за рахунок збільшення концентрації Н⁺, а внутрішня – негативно за рахунок її зменшення і нестачі іонів ОН^-, тобто створюється градієнт електричного потенціалу.Отже, ланцюг перенесення електронів працює як протонна помпа, перекачуючи протони з матриксу на зовнішній бік мембрани (рис. 3.10).

В результаті цього створюється різниця концентрацій протонів і одночасно різниця електричних потенціалів із знаком плюс на зовнішній поверхні мембрани.

Таким чином, на внутрішній мембрані одночасно з градієнтом концентрації протонів і виникає градієнт електричного потенціалу.

Розрахунки показали, що дихальний ланцюг мітохондрій при перенесенні двох протонів створює потенціал у 0,25 В.

Електрохімічний потенціал, який створився, примушує протони при їх надлишку на зовнішньому боці мембрани рухатися (за градієнтом концентрації) у зворотному напрямку – з зовнішньої мембрани у внутрішню (в матрикс). Проте мембрана є не проникною для них, за винятком окремих ділянок – протонних каналів, які є в ферментативному комплексі Н⁺-АТФ-синтетази. Зворотна дифузія протонів в матриксі призводить до зрівноваження різниці концентрацій Н⁺ і відбувається розрядження внутрішньої мембрани (зникає електричний потенціал). Одночасно в активному центрі ферменту Н^+_АТФ-синтетази відбувається процес окиснювапьного фосфорилування.

Різниця потенціалів, яка виникла при перенесенні (зворотному) двох протонів, в 0,25 В повністю достатня для утворення однієї молекули АТФ. Так, при спряженні тканинного дихання з окиснювальним фосфорилуванням створюється колообіг іонів водню (зарядження і розрядження внутрішньої мембрани, що називається протонним циклом). Тому хеміосмотичну концепцію називають ще протонрухливою. Саме цей зворотній потік протонів і служить рушійною силою для синтезу АТФ.

3.5.1. Роль АТФ-синтази в механізмі фосфорилування. Відповідно до хеміосмотичної концепції протони, виведені назовні за рахунок енергії перенесення електронів, знову проникають всередину, в мітохондріальний матрикс. Але внутрішня мембрана непроникна для них за винятком спеціальних ділянок – протонних каналів. У ділянці цих каналів розташовується Н⁺-АТФ – синтетаза, яка є протонною помпою, що забезпечує перехід іонів Н⁺ із зони з більшою концентрацією в зону з низькою, що супроводжується виділенням вільної енергії, за рахунок якої синтезується АТФ.

Встановлено, що комплекс Н⁺-АТФ-синтетаза складається з двох структурних частин: “ніжка гриба” у вигляді білкового циліндра пронизує всю товщину внутрішньої мембрани, один кінець якої взаємодіє з внутрішнім середовищем, а інший виступає в матрикс у вигляді голівки з активним центром і позначається як фактор F₁ (рис. 6.10) Toбто Н⁺ - АТФ-синтетазу можна представити як F_o+F₁. Будова, властивості та функція двох частин цього фермента зовсім різні. Молекулярна маса становить 500 000 Да, з них на F₁ припадає приблизно 340 000 Да. F₀- сильно гідратований білок, який складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів. F₁ складається з десяти субодиниць – поліпептидних ланцюгів п’яти різних типів. F₀ виконує функцію канала в мембрані, через який проходять протони, а F₁-фосфорилюючу функцію при синтезі АТФ. Цей спряжений фактор може викликати у відповідних умовах і гідроліз АТФ.

АТФ-синтетазний комплекс функціонує як єдина система, яка перетворює енергію електрохімічного градієнта іонів водню в фосфатний зв’язок молекули АТФ.

АТФ, синтезована у мітохондріях, використовується як хімічне паливо при різних енерговитратах. Тому мітохондріальну АТФ необхідно постачати в цю частину клітини, де вона необхідна. Саме тому необхідний приплив АДФ і донора фосфатної групи в мітохондрії. Вільна дифузія цих метаболітів через внутрішню мембрану мітохондрій неможлива із-за її непроникності для них. Ця проблема вирішується за рахунок існування в ліпідному шарі білкових транспортних систем: транслокази фосфату, яка постачає його в матрикс, і транслокази аденілових нуклеотидів (АДФ- АТФ – транслокази), яка переносить АДФ в мітохондрії, а АТФ - у цитоплазму.

Таким чином, мембранний потенціал визначає фізіологічно необхідний напрямок переміщення АДФ із цитоплазми і перенесення в це саме середовище АТФ.

Важливим моментом є зворотність реакції, яка каталізується АТФ-синтетазним комплексом. При відповідних умовах комплекс F₁-F₀ може розщеплювати молекулу АТФ і використовувати при цьому отриману енергію для викачування протонів та утворення електрохімічного потенціалу іонів водню.Так, каталізуючи зворотню реакцію розпаду АТФ, Н+-АТФ – синтетаза відкачує протони із внутрішнього простору назовні за рахунок енергії гідролізу АТФ. Протонні АТФази, виділені із мітохондрій тварин, вищих рослин і грибів, хлоропластів і деяких бактеріальних клітин, мають загальний тип будови та один механізм функціонування.

3.5.2. Вільне окиснення. Якщо процес тканинного дихання відокремлений від процесу фосфорилування, то енергія субстратів, які окиснюються перетворюється в тепло. Такий шлях окиснення клітинних субстратів був названий вільним окисненням. Воно необхідне в тих випадках, коли потреба в теплі для організму більша, ніж в АТФ. Наприклад, для підтримання температури тіла при охолодженні теплокровних тварин.

В організмі присутній бурий жир. Фізіологічне призначення цієї тканини – продукція тепла в процесі окиснення тригліцеридів для підтримання необхідної температури тіла. Особливістю мітохондрій цієї тканини є відсутність в них можливості синтезувати АТФ. Внутрішня мембрана мітохондрій бурого жиру має особливі пори, які є проникними для протонів. Іони водню, які продукуються при роботі дихального ланцюга, попадають назад в матрикс не через протонний канал АТФ-азного комплексу, а через ці провідні пори. Енергія окиснення перетворюється в тепло. Бурого жиру багато в новонароджених, з віком його кількість зменшується.

 

3.6. Регуляція тканинного дихання (дихальний контроль)

Утворення АТФ шляхом окиснювапьного фосфорилування регулюється згідно з енергетичними потребами клітини. Якщо отримана енергія використовується швидко, процеси біологічного окиснення прискорюються і стають більш інтенсивними. Якщо отримана енергія використовується повільно, вони сповільнюються.

Від чого залежить інтенсивність тканниного дихання і швидкість утворення АТФ?

Тканинне дихання, як і будь-який інший процес в клітині, регулюється концентрацією субстратів, які вступають у реакцію (в даному випадку – це АДФ і неорганічний фосфат) та продуктами цієї реакції (АТФ) при перенесенні електронів у дихальному ланцюзі, з припиненням якого синтез АТФ стає неможливим.

Концентрація АТФ в клітині дуже низька. Наприклад, в серці людини знаходиться не більше одного грама АТФ, а для його роботи протягом хвилини при відносному спокої організму необхідна енергія, яка відповідає 40 г АТФ. Це свідчить про те, що синтез АТФ в клітинах серця повинен здійснюватися безперервно.

Відповідно, одна і ця ж молекула АТФ повинна за одну хвилину тисячу разів гідролізуватися і знову регенеруватися.

Залежність тканинного дихання мітохондрій від концентрації АДФ називають дихальним контролем. Інтенсивність дихання регулюється співвідношенням АТФ/АДФ. Чим менше це співівідношення, тим інтенсивніше відбувається дихання, що спричинює синтез АТФ. Швидкість окиснення клітинного палива регулюється з дуже великою точністю.

Таким чином, механізм дихального контролю відрізняється високою чутливістю і точністю. Тому відносні концентрації АТФ і АДФ в тканинах змінюється в вузьких межах. Використання енергії клітиною, тобто частота обертів циклу АТФ-АДФ може змінюватися десятки і тисячі разів.