Методы микробиологических исследований

Для изучения микроорганизмов используется несколько специфических методов. Основными видами микробиологических исследований являются:

- бактериоскопическое (микроскопическое) – изучение с помощью микроскопа формы и строения микроорганизмов;

- бактериологическое – изучение культур микроорганизмов путем культивирования, т.е. выращивания на искусственных питательных средах;

- экспериментальное – определение микроорганизмов и их ядов путем заражений ими подопытных животных (мышей, белых крыс, морских свинок). Чаще всего этот метод используется для идентификации возбудителя пищевых отравлений;

- серологическое – определение микроорганизмов при помощи сыворотки крови (от serum – сыворотка), содержащей антитела. Этот метод широко используется в медицинской микробиологии.

При микробиологическом анализе пищевых продуктов применяются первые два вида исследований. Методом бактериологического исследования определяют культуральные признаки (размер, форму, структуру, цвет, блеск, профиль отдельной колонии) и биохимические особенности микроорганизмов (способность сбраживать вещество, входящее в состав различных питательных сред). При бактериоскопическом исследовании определяют морфологические особенности (размер, форму и т.д.) отдельных микроорганизмов и их способность окрашиваться различными красителями (тинкториальные свойства). Поскольку в природе существует много микробов-двойников, похожих по внешнему виду друг на друга, поэтому для определения вида микроорганизмов одной бактериоскопии обычно недостаточно, необходимо применение бактериологического метода исследования.

 

Устройство микроскопа

Величина большинства микроорганизмов измеряется микронами, или микрометрами (1 мкм = 1 × 10^-6 и = 1 × 10 ^-3 мм), поэтому рассмотреть и изучить их можно только с помощью специальных оптических приборов - микроскопов.

Основной технической характеристикой микроскопа является разрешающая способность – т.е. минимальное расстояние между двумя точками рассматриваемого предмета, на котором они не сливаются в одну и предмет виден отчетливо. В лабораторной практике наиболее широко используются биологические иммерсионные микроскопы серии «Биолам», позволяющие получить увеличение объекта до 1800 раз. Их предельная разрешающая способность равна 0,21 мкм, следовательно, пользуясь этими микроскопами, можно рассматривать объекты величиной не менее 0,21 мкм.

Принцип работы биологического иммерсионного микроскопа заключается в получении действительного обратного изображения предмета в проходящем или искусственном свете.

В микроскопе различают три части – механическую, оптическую и осветительную (см. рис.1).

Механическая часть, или штатив, состоит из опорной части - основания микроскопа 1 и тубусодержателя 2, на котором укреплены предметный столик 3, кронштейн конденсора 4 и зеркало (или осветитель) 5, а в верхней части - головка 6, наклонный тубус 7 и револьвер 8 с объективами.

Предметный столик служит для закрепления на нем рассматриваемого предмета (препарата), он может перемещаться в горизонтальной плоскости с помощью винтов 9.

 

Рисунок 1 - Микроскоп «Биолам Р 1У4.2»

 

Фокусировка препарата достигается перемещением тубуса с помощью механизма, который приводится в движение двумя винтами – макрометрическим 10 (грубая фокусировка) и микрометрическим 11 (тонкая фокусировка). Одним оборотом микрометрического винта тубус передвигается на 0,1 мм. При вращении винтов по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, при вращении против часовой стрелки - поднимается.

Внимание! Микрометрический винт - одна из наиболее хрупких частей микроскопа и обращаться с ним нужно наиболее осторожно!

Оптическая часть микроскопа представлена объективами 12 и окуляром 13.

Объектив - это основная часть микроскопа. Он состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Увеличение объектива зависит от фокусного расстояния передней (фронтальной) линзы – единственной линзы, дающей увеличение. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Расположенные над ней корреляционные линзы предназначены для получения более четкого изображения (устранения дефектов изображения – сферической и хроматической аберраций). Увеличение, которое дают объективы, указано цифрами на их оправе.

В зависимости от степени даваемого увеличения объективы делятся на объективы малого, среднего и большого увеличений.

Объективы малого увеличения (3^х, 5^х, 8^х, 9^х, 10^х) применяют главным образом для предварительного осмотра препарата. Объективы среднего увеличения (20^х, 40^х, 60^х) – для изучения крупных клеток микроорганизмов (например, грибов). Эти объективы называют сухими, поскольку при микроскопии между фронтальной линзой и препаратом находится воздух. Вследствие различия показателей преломления воздуха (n = 1) и стекла (n = 1,52) часть лучей, освещающих препарат, рассеивается и не попадает в объектив.

Объективы больших увеличений (85^х, 90^х) называются иммерсионными. Их применяют для изучения мелких форм микроорганизмов (например, бактерий). При работе с ними препарат должен быть максимально освещен. Светорассеивание, неизбежное при работе с объективами, в данном случае устраняется благодаря использованию иммерсионных жидкостей, показатель преломления которых близок к показателю преломления стекла. Чаще всего используют кедровое масло, у которого n=1,515. Каплю жидкости наносят на препарат и погружают в нее объектив. Короткое фокусное расстояние объективов большого увеличения ((1,9 - 2,1)мм) позволяет исследовать объект, не поднимая объектив из капли, вследствие чего создается однородная среда между линзой и препаратом.

Окуляр состоит из двух линз, заключенных в общую металлическую оправу. Верхняя линза называется глазной, нижняя – собирательной. Окуляр лишь увеличивает изображение, даваемое объективом. Микроскопы системы «Биолам» снабжены окулярами, дающими увеличение 7^х, 10^х и 15^х (цифры указаны на оправе).

Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, если увеличение объектива 90^х, а окуляра 15^х, то общее увеличение равно 1350^х.

Осветительное устройство расположено под предметным столиком. Его назначение – освещение поля зрения препарата. В осветительном устройстве различают зеркало, либо осветитель, и конденсор с ирисовой диафрагмой 14.

Конденсор представляет собой систему сильных линз и служит для усиления яркости освещения рассматриваемого объекта. Он собирает отраженные от зеркала лучи света в пучок и концентрирует их в плоскости препарата. Передвигается конденсор в вертикальном направлении при помощи винта 15. При опускании конденсора поле зрения микроскопа затемняется, при поднятии – освещается.

Ирисовая диафрагма расположена под конденсором. Она состоит из тонких металлических сегментов, которые при помощи рычажка можно сдвигать или раздвигать, регулируя этим поступление света в конденсор.