Расчет активности производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений.

 

Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют, как опытные.

Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду.

Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с•л).

Норма лактатдегидрогеназы (ЛДГ общ) крови

Нормы ЛДГ крови
взрослые	0,8-4 мкмоль/ч*л	140-350 Ед/л
новорожденные	2,0-8 мкмоль/ч*л	400-700 Ед/л

Оптический тест Варбурга определения ЛДГ (общая)

Принцип: Метод основан на уменьшении поглощения НАДН-Н+ в процессе превращения пировиноградной кислоты в молочную при длине волны 340 нм и температуре 37°С — оптический тест Варбурга.

Реактивы:

0,1 М фосфатный буфер, рН 7,6, его приготавливают путем сливания 90 мл 0,2 М раствора Na2HPO4 (28,4 г растворяют в 1000 мл дистиллированной воды) и 10 мл 0,2 М раствора КН2РО4 (27,2 г растворяют в 1000 мл дистиллированной воды) и добавлением к этой смеси 100 мл дистиллированной воды. рН раствора контролируется с помощью рН-метра.

Раствор НАДН-Н+ - 4,5 мг в 1,5 мл дистиллированной воды.

Раствор пировинограднокислого Na — 7,5 мг в 3 мл дистиллированной воды.

0,9% раствор NaCl.

Ход определения. В пробирку вносят 2,7 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4, 0,1 мл раствора НАДН-Н+ и 0,1 мл сыворотки, а в кювету от спектрофотометра — 0,1 мл раствора пировинограднокислого Na. Пробирку и кювету помещают в водяной термостат при 37°С на 5 минут. Затем выливают содержимое пробирки в кювету и с максимальной быстротой измеряют в спектрофотометре поглощение смеси при длине волны 340 нм против контрольной пробы (кюветы с дистиллированной водой). Затем опытную кювету снова помещают в водяной термостат и через каждые 2 минуты в течение 6 минут измеряют поглощение смеси. В процессе реакции наблюдается постепенное уменьшение оптической плотности ввиду снижения в пробе количества НАДН- Н+ (он превращается в НАД — никотинамиддинуклеотид окисленный), имеющего максимум поглощения при длине волны 340 нм. НАД, как известно, при этой длине волны имеет максимальное поглощение. Снижение оптической плотности за каждые 2 минуты должно равняться 0,04-0,08. При большей активности фермента сыворотку соответствующим образом разводят 0,9% раствором NaCl.

Активность выражают в мкмоль субстрата (мин*1000 мл сыворотки).

Для расчета активности фермента (АФ) применяется следующая формула:

АФ = А*0,483*1000/0,1, где А — среднее снижение оптической плотности за 1 минуту; 0,483 — коэффициент пересчета оптической плотности в мкмоль, 1000 - 1000 мл сыворотки, 0,1 — количество мл сыворотки в пробе.

Определение активности ЛДГ 1 (a-ГБДГ) в сыворотке крови кинетическим методом

НАЗНАЧЕНИЕ

HBDH является изоферментом лактатдегидрогеназы и содержится в миокарде. Возрастание активности HBDH в крови является чувствительным и специфическим признаком инфаркта миокарда.

МЕТОД

HBDH катализирует реакцию гидроксилирования α-кетобутирата с образованием α-гидроксибутирата с од­новременным окислением β-NАDН₂ до β-NАD. Скорость уменьшения оптической плотности при длине вол­ны 340 нм пропорциональна активности фермента в пробе.

СОСТАВ НАБОРА

Реагент 1 2 х 50 мл

Трис буфер (рН = 7,5) 0,05 моль/л

α-Кетобутират 0,03 моль/л

Азид натрия < 0,1 %
2. Реагент 2 1 х 12 мл

Трис буфер (рН = 1 0,4) 0,05 моль/л

р^АДН₂ 2,68 ммоль/л

Азид натрия < 0,1 %

ПРОБЫ

Сыворотка, плазма (гепарин, ЭДТА) без гемолиза (в эритроцитах высокое содержание HBDH). Активность HBDH в сыворотке и плазме сохраняется в течение 3 дней при хранении 2...8°С

УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЯ Длина волны 340 (365 - 334) нм; Температура 37°С

Измерение: кинетическое, реакция с уменьшением оптической плотности

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до 37°С. Температура должна быть стабильной (+/- 0,5°С) в течение всего определения.

Добавить в термостатированную кювету (мкл)

Проба 50

Реагент 1 1500

Тщательно перемешать, инкубировать 1 минуту при 37°С.

Реагент 2 150

Тщательно перемешать и запустить секундомер. Измерить оптическую плотность опытной пробы ровно че­рез 1 минуту. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 минуту.

ВЫЧИСЛЕНИЕ

Вычислить среднее изменение оптической плотности за 1 минуту (АА/мин). Для расчета активности HBDH в пробе полученное значение АА/мин умножьте на следующий фактор: Е/л (37°С) = АА/мин х 5400

Пропорциональное изменение объемов реагентов и пробы не влияет на конечный результат.

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ

Диапазон измерений 3 - 500 Е/л. Если активность фермента превышает 500 Е/л, добавьте к 0,1 мл исход­ной пробы 0,9 мл физиологического раствора и повторите исследование. Полученный результат умножьте на 1 0 (коэффициент разведения).

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ

72 - 1 82 Е/л

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Для проведения контроля качества рекомендуется использовать контрольные сыворотки с аттестованными для этого метода значениями HBDH.

На результат теста не влияет присутствие в пробе билирубина в концентрации до 684 мкмоль/л, триг-лицеридов в концентрации до 17,1 ммоль/л и аскорбиновой кислоты в концентрации до 1,7 ммоль/л. Гемолизированные образцы не пригодны для проведения анализа вследствие высвобождения HBDH из эритроцитов.