Основные методы исследования фагоцитарного механизма иммунного ответа применяемые в клинике

Для оценки фагоцитарной системы чаще всего используется определение: - -

*фагоцитарного индекса нейтрофилов и моноцитов;

* бактерицидности нейтрофилов и моноцитов;

*образования активных форм кислорода и азота;

* хемотаксиса;

* экспрессии на лейкоцитах молекул адгезии.

Поэтому именно на нейтрофилах оценивают поглотительную и метаболическую функциональную активность фагоцитов крови, ставя два нижеприведённых теста: НСТ-тест и тест фагоцитоза с латексом. Тесты спонтанного и стимулированного фагоцитоза проводятся с использованием частиц латекса. Фагоцитоз с латексом основан на поглощении частиц латекса нейтрофилами (адгезия, захват и полное поглощение). При проведении спонтанного теста лейкоциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц латекса; при проведении теста индуцированного фагоцитоза к полученной смеси добавляют раствор пирогенала. После инкубирования при 37° С в течение 30 минут готовят мазки, а затем в фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках подсчитывают процент нейтрофилов; поглотивших латекс.

Тест восстановления нитросинего тетразолия - HCT'mecm основан на восстановлении лейкоцитами крови с помощью активных форм кислорода нитросинего тетразолия в диформазан. При этом используется способность ферментов, опосредующих Киллинг бактерий в фагоцитах, изменять окраску нитросинего тетразолия от изначально желтой до сине-фиолетовой (внутркядерные включения - глыбки диформазана). Постановка реакции. На обезжиренное предметное стекло наносят 0,02 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,02мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ (нитросинего тетразолия). В качестве нагрузки используют коммерческий липополисахарид грамотрицательных бактерий Е.соli или раствор пирогенала в разведении 1:IO. На другое обезжирешое стекло наносят 0,02 мл ЛПС, 0,02 мл нейтрофилной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ. Помещают во влажную камеру на 30 мин. готовят мазки, высушивают,фиксируют. Окрашивают 0,1% раствором нейтрального красного. Учитывают нейтрофилы, высчитывая % лейкоцитов с гарнулами восттановленного НСТ(диформазан синего цвета)

Неспецифическая клеточная защита организма осуществляется лейкоцитами, которые способны к фагоцитозу. Фагоцитоз - это процесс узнавания, захвата и поглощения разных чужеродных структур (разрушенных клеток, бактерий, комплексов антиген-антитело и др.). Клетки, осуществляющие фагоцитоз (нейтрофилы, моноциты, макрофаги), называются общим термином - фагоциты. Фагоциты активно передвигаются и содержат большое количество гранул с различными биологически активными веществами.

Фгоцитарную активность лейкоцитов

Метод

Из крови определенным способом получают лейкоцитарную взвесь, которую смешивают с точным количеством лейкоцитов (1млрд микробов в 1 мл). Через 30 и 120 мин готовят мазки из этой смеси и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Под микроскопом просматривают около 200 клеток и определяют количество фагоцитов, которые поглотили бактерии, интенсивность их захвата и уничтожения.
1. Фагоцитарный индекс - это процент фагоцитов, поглотивших бактерии через 30 и 120 мин, к общему количеству просмотренных клеток.
2. Фагоцитарный показатель - среднее число бактерий, находящихся в фагоците через 30 и 120 мин (производят математическое деление общего числа поглощенных фагоцитами бактерий на фагоцитарный индекс)
3. Индекс завершенности фагоцитоза - рассчитывается делением числа убитых бактерий в фагоцитах на общее число поглощенных бактерий и умножением на 100

 

БИЛЕТ

1 Классификация гиперчувствительности по джеллу и кумбсу

Изучение молекулярных механизмов аллергии привело к созданию Джейлом и Кумбсом в 1968 г. новой классификации. В соответствии с ней различают четыре основных типа аллергии: анафилактический (I тип), цитотоксический (II тип), иммунокомплексный (III тип) и опосредованный клетками (IV тип). Первые три типа относятся к ГНТ, четвертый — к ГЗТ. Ведущая роль в запуске ГНТ играют антитела (IgE, G и М), а ГЗТ — лимфоидно-макрофагальная реакция.

Аллергическая реакция I типа связана с биологическими эффектами IgE и G4, названных реагинами, которые обладают цитофильностью — сродством к тучным клеткам и базофилам. Эти клетки несут на поверхности высокоаффинный FcR, связывающий IgE и G4 и использующий их как ко-рецепторный фактор специфического взаимодействия с эпитопом аллергена. Связывание аллергена с рецепторным комплексом вызывает дегрануляцию базофила и тучной клетки — залповый выброс биологически активных соединений (гистамин, гепарин и др.), содержащихся в гранулах, в межклеточное пространство. В результате развиваются бронхоспазм, вазодилатация, отек и прочие симптомы, характерные для анафилаксии. Вырабатываемые цитокины стимулируют клеточное звено иммунитета: образование Т2-хелпера и эозинофилогенез.

Цитотоксические антитела (IgG, IgM), направленные против поверхностных структур (антигенов) соматических клеток макроорганизма, связываются с клеточными мембранами клеток-мишеней и запускают различные механизмы антителозависимой цитотоксичности (аллергическая реакция II типа). Массивный цитолиз сопровождается соответствующими клиническими проявлениями. Классическим примером является гемолитическая болезнь в результате резус-конфликта или переливания иногруппной крови.

Цитотоксическим действием обладают также комплексы антиген-антитело, образующиеся в организме пациента в большом количестве после введения массивной дозы антигена (аллергическая реакция III типа). В связи с кумулятивным эффектом клини­ческая симптоматика аллергической реакции III типа имеет отсроченную манифестацию, иногда на срок более 7 суток.

Лабораторная диагностика аллергии при аллергических реакциях I типа основана на выявлении суммарных и специфических реа­гинов (IgE, IgG4) в сыворотке крови пациента. При аллергических реакциях II типа в сыворотке крови определяют цитотоксические антитела (антиэритроцитарные, антилейкоцитарные, антитромбоцитарные и др.). При аллергических реакциях III типа в сыворотке крови выявляют иммунные комплексы. Для обнаружения аллергических реакций IV типа применяют кожно-аллергические пробы, которые широко используют в диагностике некоторых инфекционных и паразитарных заболеваний и микозов (туберкулез, лепра, бруцеллез, туляремия и др.).

Тип реакции	Фактор патогенеза	Механизм патогенеза	Клинический пример
I. анафилактический (ГНТ)	IgE IgG4	Образование рецепторного комплекса IgE (G4)-АсК тучных клеток и базофилов → Взаимодействие эпитопа аллергена с рецепторным комплексом → Активация тучных клеток и базофилов → Высвобождение медиаторов воспаления и других биологически активных веществ	Анафилаксия, анафилактический шок, поллинозы
II. цитотоксический (ГНТ)	IgM IgG	Выработка цитотоксических антител → Активация антителозависимого цитолиза	Лекарственная волчанка, аутоиммунная гемолитическая болезнь, аутоиммунная тромбоцитопения
III. иммунокомплексный (ГНТ)	IgM IgG	Образование избытка иммунных комплексов → Отложение иммунных комплексов на базальных мембранах, эндотелии и в соединительнотканной строме → Активация антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности → Запуск иммунного воспаления	Сывороточная болезнь, системные заболевания соединительной ткани, феномен Артюса, «лёгкое фермера»
IV. клеточно-опосредованный (ГЗТ)	Т-лимфоциты	Сенсибилизация Т-лимфоцитов → Активация макрофага → Запуск иммунного воспаления	Кожно-аллергическая проба, контактная аллергия, белковая аллергия замедленного типа