Схема постановки основного опыта РСК

№ системы	Ингредиенты, мл	Опыт	Контроли
сыворотки	антигена
1.	Исследуемая сыворотка в разведении 1:5 Антиген (рабочая доза)   Комплемент (рабочая доза)   Изотонический раствор хлорида натрия	0,5   0,5   0,5   - 37° С – 1 ч	0,5   -   0,5   0,5	-   0,5   0,5   0,5
2.	Гемолитическая система*	1,0 37° С – 1 ч	1,0	1,0

Примечание: * - гемолитическую систему готовят, смешивая в равных количествах гемолитическую сыворотку в тройном титре и 3% взвесь эритроцитов барана; выдерживая смесь в течение часа при 37° С.

 

Результаты РСК предварительно учитывают после извлечения пробирок из термостата и окончательно – спустя 15-18 ч после пребывания их при комнатной температуре или в холодильнике.

Интенсивность реакции выражают плюсами:

++++ - реакция резко положительная, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (эритроциты оседают на дно, жидкость бесцветная);

+++ - реакция положительная, характеризующаяся частичным гемолизом (лизировано ~ 25% эритроцитов, осадок меньше, жидкость розовая);

++ - реакция положительная, характеризующаяся гемолизом (лизировано ~50% эритроцитов, осадок небольшой, жидкость розовая);

+ - реакция сомнительная (лизировано ~75% эритроцитов, незначительный осадок, жидкость интенсивно окрашен1.;

_ - реакция отрицательная (лизированы все эритроциты, жидкость интенсивно окрашена и прозрачна – лаковая кровь).

Достоверность результатов подтверждается контролями ингредиентов. Заполните дома таблицу 2.

Таблица 2.

№ пп	Контроли	Контролируемое свойство
1.	КС = С + К + Г + Э + физ. раствор
2.	КА = А + К + Г + Э + физ. раствор
3.	КГС = К + Г + Э + физ. раствор
4.	КГ = Г + Э + физ. раствор
5.	КЭ = Э + физ. раствор
6.	КК = К + Э + физ. раствор

Обозначения:

С – сыворотка; А – антиген; К – комплемент; Г – гемолитическая сыворотка;

Э – эритроциты; ГС – гемолитическая система.

 

Оценка результатов: положительная реакция с интенсивностью не меньше ++ при достоверных контролях свидетельствует о наличии антител и серологическом подтверждении клинического диагноза; отрицательная реакция при достоверных контролях свидетельствует о том, что антитела не выявлены и серологически клинический диагноз не подтвержден.

РСК используется, помимо диагностики хронической гонорее, при риккетсиозах, вирусных и других инфекциях.

2. Учтите и оцените результаты РИФ (прямой) с исследуемым материалом (отделяемое карбункула) и люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой.

Постановка: готовится фиксированный препарат-мазок из исследуемого материала, на который наносится люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка, содержащая антитела к бациллам сибирской язвы, меченные флюоресцентным красителем (ФИТЦ – флюоресцеина изотиоцианат). Препарат помещают во влажную камеру, инкубируют 30 мин при 37°С, после чего его промывают водой и высушивают. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, позволяющего освещать препарат ультрафиолетом, что заставляет флюорохром светиться.

Критерии учета и оценки: при положительной РИФ – в результате соединения специфических антител, меченых флюорохромом, с антигенами микробных клеток в препарате выявляют светящиеся микроорганизмы, сходные по морфологии, размерам и взаимному расположению с предполагаемым возбудителем.

Бациллы сибирской язвы – это крупные палочки длиной до 7-8 мкм, с обрубленными концами, располагающиеся в патологическом материале короткими цепочками, парами или одиночно.

3. Учтите и оцените результаты ИФА с сыворотками доноров на ВИЧ-инфекцию.

Постановка: для определения специфических антител используют специальные панели из полистирола, в лунках которых фиксирован инактивированный вирус или его антигены. В лунки вносят сыворотки обследуемых и инкубируют. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием буферным раствором. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные пероксидазой. Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то на данном этапе они, выступая в качестве антигена, прореагируют с меченными античеловеческими антителами. Добавление после отмывки субстрата (ортофенилендиамина – ОФ5. позволяет учесть результаты реакции. Образование продукта, окрашенного в желто-коричневый цвет, оценивается как положительная реакция.

Критерием достоверности являются контроли: с сывороткой, заведомо содержащей антиВИЧ - ИФА «+» и сывороткой, заведомо не содержащей антиВИЧ — ИФА «-».

Для проведения ИФА широко используют 96-луночные полистироловые планшеты, т. к. на полистироле легко адсорбируются антитела, а после специальной обработки – различные антигены. Для работы с этими планшетами используются многоканальные автоматические пипетки, позволяющие вносить ингредиенты одновременно в несколько лунок панели, а также автоматические и полуавтоматические устройства для промывания лунок. Существуют и специальные автоматы, позволяющие осуществлять все эти этапы ИФА практически без участия человека.

4. Ознакомиться и описать в таблице: антиген для реакции Вассермана, диагностические сыворотки для РСК, диагностикумы для РСК; люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка (ФИТЦ), тест-система иммуноферментная для определения антител к ВИЧ.

5.4. Итоговый контроль знаний:

- вопросы для самоконтроля:

1. Цель прогревания (56° 30 мин.) сывороток, используемых в РСК.

2. Методика постановки ИФА с целью определения специфических антител.

3. Методика постановки ИФА с целью определения специфического антигена.

4. Методика постановки РИФ с целью экспресс-диагностики заболеваний.

5. Назовите отличие непрямой РИФ от прямой и ее преимущества при определении специфических антигенов.

-решение ситуационных задач.

ЗАДАЧА №1. При постанове РСК с сывороткой обследуемого с клиническим диагнозом «коклюш» в контроле гемолитической системы наблюдается задержка гемолиза.

1. Можно ли учитывать данную реакцию? Если нет, то почему?
2. Назовите диагностические системы РСК.
3. Перечислите компоненты каждой системы?

ЗАДАЧА №2. При постановке РСК с сывороткой обследуемого с клиническим диагнозом «бруцеллез» получены следующие результаты: реакция достоверна по контролям, в опыте задержка гемолиза.

1. Назовите цель исследования.
2. Интерпретируйте полученные результаты.

ЗАДАЧА №3. С материалом от обследуемой К. с клиническим диагнозом «урогенитальный хламидиоз» была поставлена РИФ.

1. С какой целью была поставлена РИФ?
2. Что является критерием учета и оценки РИФ?

ЗАДАЧА №4. В родильный дом поступила беременная женщина, у которой при исследовании сыворотки крови был определен маркер вируса гепатита B.

1. Какая серологическая реакция была использована при диагностике гепатита В?
2. В чем сущность серологической реакции, которая была использована.

ЗАДАЧА №5. В анонимный кабинет обратился гражданин К. с просьбой проверить его на инфицирование ВИЧ. В процедурном кабинете у гражданина К. была взята кровь.

1. Назовите, какой метод был использован для диагностики ВИЧ-инфекции. В чем его суть?
2. Назовите критерии достоверности полученного результата.

 

6. Домашнее задание для уяснения темы занятия.

Занятие № 11 Иммунопрофилактика, иммунотерапия инфекционных заболеваний. Контрольное занятие: Инфекция, иммунитет, аллергия.

7. Список тем по НИРС, предлагаемый кафедрой:

1. История применения РСК в диагностике инфекционных заболеваний.
2. Практическое применение РИФ и ИФА.
3. Чувствительность и специфичность РИФ, ИФА при диагностике различных заболеваний

8. Рекомендуемая литература по теме занятия:

Обязательная:

1. Поздеев, О. К. Медицинская микробиология: учеб. пособие / О.К. Поздеев – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 768 с.

Дополнительная:

1. Ярилин, А.А. Иммунология: учебник / А.А. Ярилин – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 с.

2. Гиллеспи, С.Х. Наглядные инфекционные болезни и микробиология / С.Х. Гиллеспи, К.Б. Бамфорд – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 136 с.

3. Хаитов, Р.М. Иммунология: учебник / Р.М. Хаитов – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 528 с.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: 1 т.: учебник / ред. В.В. Зверев [и др.] – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.- 448 с.

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: 2 т.: учебник / ред. В.В. Зверев [и др.] – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.- 480 с.