Пример построения калибровочной кривой

Пусть требуется построить калибровочную кривую для определения в сыворотке (плазме) крови концентрации вещества А. Если оно у практически здоровых людей составляет 60—80 г/л, то для построения калибровочной кривой используют растворы стандарта с концентрацией, охватывающей физиологические величины и выходящей за их пределы. Выбирают, например, интервал значений 20—120 г/л. Поскольку стандартное вещество — как правило, дефицитный реактив, а со временем техника выполнения анализа совершенствуется, то для сохранения стандарта и соблюдения одинаковых условий определения на протяжении всего периода исследований строить калибровочную кривую можно лишь после того, как возникает уверенность в том, что техника аналитических определений достаточно хорошо отлажена и в дальнейшем не будет изменяться. Об этом свидетельствует хорошая воспроизводимость результатов в серии и изо дня в день.

Сначала готовят основной раствор. Чем он концентрированнее, тем дольше сохраняется в нем стандартное вещество. Даже если концентрация основного стандартного раствора является неточной (процентной), готовить его следует, пользуясь весами для очень точного взвешивания и точной мерной посудой. Иногда приготовляют промежуточные разбавления (перед получением ряда рабочих растворов стандарта), но чаще всего из основного раствора сразу получают конечные разбавления. Из каждого разведения основного раствора стандарта с концентрацией 20, 40, 60, 80, 100 и 120 г/л отбирают, к примеру, по 0,1 мл раствора (ровно столько, сколько берется сыворотки или другого биологического материала для исследования) и вносят в первые три пробирки каждого из трех рядов их, размещенных в большом четырехрядном штативе. В последующем в пробирки добавляют «цветной» реагент известного объема. Определяют экстинкцию каждого из растворов, содержащих одинаковое количество стандартного вещества, и полученные значения абсорбции усредняют (если одно из трех «выскакивает», то его не учитывают: оно знаменует собой техническую ошибку взвешивания). Допустимо наносить (в виде крестика) каждое из трех определений в выбранной системе координат и в дальнейшем из них брать среднее по расположению в системе координат.

На миллиметровой (калибровочной) бумаге вычерчивают оси координат. На оси ординат откладывают значения абсорбции, на оси абсцисс — концентрации. Чтобы считываемые с калибровочной кривой значения были более точными, следует брать масштаб графика достаточно крупным.

Опыт работы показывает, что масштаб калибровочного графика должен быть 20 см и более на общих осях. Чтобы кривая располагалась под углом ~ 45° к осям, берут максимальные значения концентрации и абсорбции, если между ними в пределах этих значений сохраняется прямо пропорциональная зависимость. В приведенном нами конкретном примере отрезок из 20 крупных (односантиметровых, десятимиллиметровых) клеток на оси абсцисс составляет 120 г/л, а на оси ординат максимальное из полученных для 6 определений значение абсорбции равно 0,6. На основании этих данных находят факторы калибровки по формулам (1) и (2).

(1)

 

(2)

где 6 г/л и 0,03 — значения концентрации и абсорбции, соответствующие масштабу 1 см (одна крупная клетка). Разделив 6 г/л и 0,03 на 10, находят цену 1 мм деления на осях абсцисс и ординат.

Через точки, обозначенные крестиками, проводят линию, пользуясь прозрачной линейкой, так, чтобы она проходила через большинство точек. Точки, не попавшие на линию, должны располагаться поблизости от нее, будучи равномерно удалены в ту и другую стороны.

Чтобы облегчить процедуру откладывания на оси ординат значений абсорбции стандартных и опытных проб, рекомендуется разделить величину экстинкции (например 0,2) на 0,03 (0,2/0,03). Полученное число (в данном случае 6,67) показывает, на каком удалении от нулевой точки в сантиметрах следует сделать отметку для восстановления из нее перпендикуляра: отмеряют отрезок в 6 крупных (1 см) клеток и 7 мм. Так же поступают со всеми остальными значениями, чтобы их разместить на вертикальной и горизонтальной осях. Из отложенных на осях значений восстанавливают перпендикуляры, места пересечения тонких линий обозначают крестиками; ориентируясь на них, проводят калибровочную кривую.

Помимо нахождения факторов, отражающих цену деления большой и малой клетки на горизонтальной и вертикальной осях, рассчитывают фактор пересчета по формуле: ƒ = С/А. При этом лучше всего найти соответствующий фактор для каждой из шести точек измерений и затем установить среднее значение этих показателей:

С помощью микрокалькулятора можно быстро определить концентрацию вещества в опытной пробе по формуле: С = ƒ А, даже если число ƒ не круглое.

Цену деления на оси ординат можно найти и другим способом. Пусть А1 = 0,28; С1 = 60 г/л; А2 = 0,40; С2 = 80 г/л. Составляем пропорцию: 0,28 — 60, 0,01 — X.

На осях координат отмеривают одинаковые отрезки для соответствующих показателей абсорбции и концентрации.