Методические указания к практическому заданию 30

Метод определения гиалуронидазы

Готовится гиалуроновая кислота из пупочных канатиков. Для этого свежие пупочные канатики очищаются от крови, разрезаются, освобождаются от сосудов, измельчаются ножницами, взвешиваются, заливаются двойным количеством воды и варятся до оседания кусочков на дно (до кипения не доводить). Раствор пропускают через марлевый фильтр. Фильтрат является гиалуроновой кислотой.

2-миллиардная взвесь суточной агаровой культуры бактерий разливается в пробирки, добавляется рабочее количество гиалуроновой кислоты. Объем жидкости доводят до 1 мл физратвором. Добавляется по 3 капли 15 %-й уксусной кислоты. Ингредиенты осторожно смешивают и учитывают результат.

С уксусной кислотой гиалуроновая кислота должна давать сгусток.

Если штамм продуцирует гиалуронидазу высокой активности, муциновый комочек образуется только в шестой пробирке (контроль). В опытных пробирках жидкость будет равномерно мутной. Если активность фермента невелика, то образование сгустка наблюдается только в первых 2 или 3 пробирках. При отрицательной реакции во всех пробирках образуются сгустки.

Задание 31. Определение нейраминидазной активности микробов:

- культуральную жидкость 72-часовой бульонной культуры синегнойной палочки залить по 0,2 мл в пробирки, добавить по 0,4 мл смеси овомуцина (яичный белок) пополам с фосфатным буфером 0,1 М рН 6,0;

- после одночасового инкубирования в термостате при t 37 °С в пробирки внести по 0,4 мл 4,0 %-го арсенита Na в 0,5 н растворе серной кислоты. Смесь встряхнуть до исчезновения желтой окраски;

- затем добавить по 0,3 мл 0,1 М раствора тиобарбитуровой кислоты, рН 9,0 и пробирки поместить в кипящую водяную баню на 5–7 мин, охладить на льду и в каждую из них внести по 5 мл бутанола;

- появляющееся интенсивное окрашивание смеси свидетельствует о наличии нейраминидазы;

- сделать заключение по заданию.

Задание 32. Определение проявления действия микробных токсинов:

- демонстрация и определение гемолитического действия, вызываемого стафилококками, стрептококками, кишечной палочкой на кровяном агаре;

- столбнячного, ботулинического экзотоксина на мышах (на таблицах и слайдах);

- сделать заключение по заданию.

Задание 33. Определение лизоцимной активности бактерий:

- взвесь миллиардной суточной культуры Micrococcus 0,2 мл засеить в слой 0,7 %-го питательного агара в чашке Петри;

- на поверхность подсушенного агара (с микрококком) петлей в виде бляшек нанести суточные культуры исследуемых штаммов. На одну чашку засеить до 9 исследуемых штаммов;

- посевы инкубировать в термостате в течение 24 ч при 37 °С;

- учесть наличие зон лизиса микрококка вокруг колонии исследуемой культуры с помощью бинокулярной лупы в мм;

- сделать заключение.