Иммобилизованные ферменты

Иммобилизованными называют такие ферменты, которые выделены из клетки, искусственно закреплены на носителе и сохраняют свойственную им каталитическую активность.

Иммобилизация — это технология, согласно которой молекулу фермента включают в какую-либо фазу или соединяют с нерастворимым носителем. Комплекс «фермент — носитель» отделен от раствора, но при этом может обмениваться с ним молекулами субстрата, эффектора или ингибитора. В промышленных целях для иммобилизации используют главным образом энзимы, выделенные из микроорганизмов. Они примерно в 100 раз дешевле, чем ферменты животного или растительного происхождения, и более доступны.

По сравнению со свободными ферментативными препаратами, иммобилизованные ферменты имеют существенные преимущества:

— они обладают высокой стабильностью, в несколько тысяч раз превышающей стабильность свободных ферментов, и поэтому достаточно долговечны;

— они легко отделимы от реакционной среды, что позволяет получать чистые продукты реакции;

— иммобилизация дает возможность многократно использовать ферментативный препарат;

— иммобилизованные ферменты технологичны, что позволяет либо вести процесс непрерывно, регулировать его скорость и, соответственно, выход продукта, либо в любой момент остановить реакцию;

— с помощью подбора носителей и методов иммобилизации можно целенаправленно изменять некоторые свойства ферментов (специфичность, рН- и температурозависимость, стабильность) для оптимизации процесса.

Процесс иммобилизации как способ сохранения активности выделенного из клетки фермента был открыт еще в начале XX в. В 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахараза, адсорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность. Однако первый патент на применение иммобилизованных ферментов был выдан только в 1939 г. Дж. Пфанмюлеру и Г. Шлейху, которые предложили использовать протеолитические ферменты, адсорбированные на древесных опилках, для обработки шкур животных. В 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт разработали принципиально новый метод для иммобилизации ферментов — ковалентное связывание. Что касается термина «иммобилизованные ферменты», то он был узаконен в 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии, которая проходила в США.

Носители для иммобилизации ферментов должны обладать определенными свойствами:

— высокой биологической и химической стойкостью;

— нерастворимостью;

— высокой механической прочностью;

— значительной гидрофильностью, которая обеспечивает связывание фермента с носителем в водной среде;

— достаточной проницаемостью для ферментов, коферментов, субстратов и продуктов реакции, пористостью,большой удельной поверхностью;

— легкостью активации комплекса «фермент — носитель»;

— возможностью создания различных структур (мембран, пластин, трубочек, гранул);

— низкой стоимостью.

В зависимости от структуры, носители подразделяют на природные и синтетические, органические и неорганические, полимерные и низкомолекулярные.

Природные полимерные носители по своей химической природе подразделяют на белковые (кератин, фиброин, коллаген, желатин), полисахаридные (целлюлоза, декстран, агароза, каррагинан, альгиновые кислоты и их соли, аминополисахариды — хитин и хитозан) и липидные (модель «фермент — липид» в виде монослоя или бислоя сферической формы — липосома), наиболее приближенные к естественным комплексам, существующим в клетке.

Синтетические полимерные носители подразделяют на три группы — полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные. Благодаря разнообразию, механической прочности и доступности, они широко используются для иммобилизации. Кроме того, при производстве синтетических полимеров можно значительно разнообразить их форму (гранулы, трубочки и т. д.), варьировать величину пор, вводить различные функциональные группы.

Носители неорганической природы могут быть представлены материалами из глины, стекла, керамики, сили-кагеля, графитовой сажи, а также оксидами металлов и т. д. Преимущества этой группы носителей состоят в легкости регенерации, возможности получения любой их формы при производстве и вариабельности размера пор.

Методы иммобилизации ферментов. Иммобилизацию ферментов можно осуществлять физическими и химическими методами (рис. 7.3).

Физические методы основаны на адсорбции фермента на нерастворимом носителе, на включении фермента в поры поперечносшитого геля, в полупроницаемые структуры.

Адсорбция ферментов на нерастворимом носителе. Молекула фермента удерживается на поверхности носителя благодаря электростатическим, гидрофобным, дисперсионным взаимодействиям или возникновению водородных связей. Прочность связывания фермента с носителем небольшая.

Иммобилизация ферментов путем включения в гель (обычно — полимерный гель). Метод обеспечивает равномерное распределение фермента в объеме носителя, достаточно прост и применяется для иммобилизации отдельных молекул определенного энзима, мультиферментных комплексов и интактных клеток. Однако он непригоден для работы с ферментами, которые воздействуют на водонерастворимые субстраты.

Иммобилизация в полупроницаемые структуры. В этом случае раствор фермента и раствор субстрата разделяют с помощью полупроницаемой мембраны (микрокапсулирование, включение в липосомы). Метод используется главным образом в фундаментальных научных исследованиях и в медицине.

Использование химических методов приводит к возникновению ковалентных связей между ферментом и носителем. Этот способ получения промышленных биокатализаторов наиболее распространен.

Химическое присоединение энзима к носителю отличается высокой эффективностью и прочностью связи. Однако химические методы иммобилизации сложны и дороги, но незаменимы в научных исследованиях при создании ферментов с контролируемыми свойствами. Рассмотрим некоторые из этих методов.

Иммобилизация на носителях, несущих гидроксигруп-пы. В этой группе наиболее распространен бромциановый метод, который позволяет связывать фермент с полисаха-ридным или синтетическим носителем.

Иммобилизация на носителях, несущих аминогруппы. Аминогруппы носителя превращают в соли диазония, к которым впоследствии присоединяют молекулы ферментов за счет взаимодействия с фенольными, аминными, имидазольными, тиольными, гуанидиновыми группами этих ферментов. Иммобилизация на носителях, несущих сульфгидрильные группы. Если и носитель, и фермент несут сульфгидрильные группы, то под воздействием кислорода воздуха эти группы легко окисляются с образованием дисульфидных связей.

Среди всех методов иммобилизации оптимальным считается метод включения ферментов в полимерные гели. Также широко распространены адсорбционное присоединение и химические методы, основанные на ковалентном связывании. Достаточно часто иммобилизацию проводят за счет включения ферментов в мембраны и микрокапсулы, тогда как другие приемы используют в единичных случаях. Применение иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферменты находят широкое применение в различных отраслях народного хозяйства:

— в промышленности — в качестве активных компонентов стиральных и моющих средств, в дубильных процессах, в пищевых производствах, например при обработке мяса; в качестве катализаторов при проведении различных технологических процессов, для анализа различных веществ;

— в медицине — в качестве противовоспалительных, тромболитических и фибринолитических препаратов;

— в фармации — в медицинской диагностике при анализе лекарственных веществ белковой природы;

— в качестве биокатализаторов в биотехнологических производствах.

Созданы искусственные аналитические системы для анализа различных веществ — ферментные электроды, проточные анализаторы и т. д. В настоящее время разрабатываются новые поколения биодатчиков на базе аффинных взаимодействий.

7.3. Иммобилизованные полиферментные системы

О широком применении ферментов в медицине уже шла речь выше. Однако использование белковых препаратов в качестве лекарственных средств может быть ограничено их иммуногенностью, аллергенностью, малым временем действия в организме человека или животного. В связи с этим в медицине более перспективно применение иммобилизованных ферментов, которые менее аллергенны и иммуноген-ны, более стабильны, обладают пролонгированным действием. Например, при включении в липосомы ферменты защищены от эндогенных протеиназ организма пациента, а сами липосомы утилизируются в организме. В иммобилизованном виде применяют тромболитические ферменты, предотвращающие образование тромбов в кровеносных сосудах. Иммобилизованные протеолитические ферменты помогают при лечении ожогов, абсцессов, ран. Иммобилизованная уреаза используется в аппарате «искусственная почка». Микрокапсулы, заполненные аспарагиназой, применяют для лечения аспарагинзависимых опухолей.