Наследственные болезни - результат дефектов в генотипе, многообразие и распространенность. Наследственная предрасположенность к некоторым болезням (биохимические основы).

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ

Причиной наследственных болезней являются изменения (мутации) ДНК. В результате появляются аллельные варианты белков, которые могут различаться по функциональной способности. Например, HbS хуже выполняет функцию транспорта кислорода, чем НЬА. Если функция белка нарушена существенно, то «плохой» аллель проявляется как наследственная болезнь (наследственная протеино-патия). По механизму возникновения наследственные болезни можно разделить на две группы. Наследственная болезнь может возникнуть в результате мутации, которая произошла в гаметах или зиготе, давших начало данной особи. Это первая группа наследственных болезней, первичные мутации. Если первичная мутация нелетальна до репродуктивного возраста, то мутантный аллель может передаваться последующим поколениям и тоже проявляется как болезнь. Это вторая группа наследственных болезней.

В результате первичной генной мутации возникает гетерозиготность по данному локусу, поскольку одновременное повреждение сразу двух гомологичных локусов диплоидной клетки маловероятно. В гетерозиготном состоянии «плохой» аллель часто (но не всегда) не проявляется как болезнь или бывает причиной болезни, не слишком существенно снижающей жизнеспособность. Поэтому такие аллели могут сохраняться и распространяться в популяции. У родителей, каждый из которых является носителем мутантного аллеля в гетерозиготном состоянии, могут родиться дети, гомозиготные по такому аллелю: в этом случае развивается болезнь, нередко тяжелая.

Вернемся еще раз к серповидноклеточной анемии. В крови гомозигот SS имеется только HbS. Поскольку эритроциты, содержащие HbS, менее стабильны, чем эритроциты с НЬА, у таких гомозигот скорость разрушения эритроцитов больше, и наступает анемия. Серповидноклеточная анемия проявляется в общей слабости, отставании развития, желтухе; больные обычно умирают в раннем детском возрасте. Как же такой вредный для отдельных индивидов аллель сохраняется в популяции, не элиминируется отбором? Дело в том, что для популяции в целом его нельзя назвать вредным. Гетерозиготы AS имеют в эритроцитах и НЬА, и HbS; они практически здоровы или у них обнаруживаются слабые признаки болезни. С другой стороны, в эритроцитах гетерозигот хуже развивается малярийный плазмодий, и они не заболевают малярией или легко переносят ее. Вот почему в местностях, где распространена малярия, частота аллеля S велика — до 35 %. Таким образом, ген серповидноклеточности, когда-то возникший в результате мутации, приводит к гибели части людей (гомозигот) от серповидно-клеточной анемии (до миллиона детей ежегодно), но популяция в целом приспособлена к среде, где важным фактором отбора является малярийный плазмодий. После ликвидации малярии аллель S начнет исчезать из генофонда людей.

Тяжесть наследственной болезни зависит от степени повреждения функции мутантного белка по сравнению с нормальным. Например, HbC бета6Glu->Lys) по свойствам мало отличается от НЬА; даже гомозиготы СС практически здоровы или страдают легкими формами анемии. Конечно, тяжесть болезни зависит и от важности функции, выполняемой данным белком. Частота каждой в отдельности наследственной болезни невелика, однако общая частота существенна и достигает 2-4 %. В настоящее время известны тысячи разных наследственных болезней; биохимическая природа многих из них остается неизученной.

Выше речь шла о болезнях, наследственная природа которых ясно выражена: они являются моногенными и наследуются в соответствии с правилами Менделя. Кроме того, возможна полигенная наследственная (семейная) предрасположенность к болезням. Такие распространенные болезни, как атеросклероз, сахарный диабет, подагра, язва желудка, шизофрения, эпилепсия, имеют полигенную природу. Между наследственными болезнями и болезнями, вызванными факторами среды, нет резкой границы. Например, появление анемии при наследовании гемоглобина S практически не зависит от среды. С другой стороны, болезни вследствие травм, отравлений, инфекционные болезни и т. д. мало зависят от наследственности. Здесь речь идет о восприимчивости к повреждающим агентам среды. Однако дальнейшее развитие болезни всегда зависит от индивидуальных особенностей генотипа. Например, раны у одних людей заживают быстрее, у других — медленнее.

Между крайними формами болезней — наследственными и вызванными факторами среды — имеется непрерывный ряд промежуточных форм.

Примером такой промежуточной формы может быть эмфизема легких, связанная с недостаточностью aльфаl-антитрипсина. Белок сыворотки крови альфаl-анти-трипсин является ингибитором некоторых протеолитических ферментов. Он участвует в регуляции воспалительной реакции. Некоторые аллельные варианты этого белка обладают сниженной ингибиторной способностью. Индивиды, гомозиготные по таким аллелям, предрасположены к возникновению эмфиземы легких, которая обычно развивается в возрасте 40-50 лет. Если эти индивиды подвергаются раздражающим ингаляциям (производственные или бытовые загрязнения воздуха, курение), то эмфизема развивается раньше. Больше того, при этих условиях эмфизема возникает и у гетерозигот по данному аллелю, в то время как при обитании в условиях чистого воздуха они остаются здоровыми.

Таким образом, «плохой» аллель может существовать в скрытом состоянии и обнаруживает себя лишь при определенных условиях. Особенно выразительно это проявляется в случаях индивидуальной непереносимости некоторых лекарственных веществ. Рассмотрим реакцию на дитилин людей с разными аллеломорфами холинэстеразы плазмы крови. Этот фермент сходен с ацетилхолинэс-теразой нервной ткани, но отличается от нее более широкой субстратной специфичностью: он гидролизует не только ацетилхолин, но и некоторые другие эфиры, в том числе дитилин. Напомним, что дитилин применяется как миорелаксант при некоторых хирургических операциях и эндоскопических обследованиях, например при бронхоскопии. Действие дитилина в применяемых дозах обычно непродолжительно — несколько минут. Это связано с тем, что он быстро разрушается холинэстеразой плазмы. Однако в редких случаях (примерно у одного пациента из 2000) паралич мышц продолжается часами: чтобы спасти жизнь больного, его приходится все это время держать на искусственном дыхании. Оказалось, что у таких людей активность холинэстеразы плазмы крови значительно ниже, чем обычно; низкая активность обнаруживается и у родственников этих людей. Следовательно, имеются аллельные формы фермента; они различаются не только по активности, но и по другим свойствам, в частности по электрофоретической подвижности. Индивиды с низкой активностью холинэстеразы плазмы совершенно здоровы, аллельный ген обнаруживает себя лишь при введении дитилина.

Непереносимость дитилина — это следствие ясно выраженного наследственного дефекта.. В целом непереносимость дитилина в равной мере зависит от генетического дефекта и внешнего фактора. Большее значение имеют генетические дефекты, проявляющиеся как непереносимость некоторых пищевых веществ, поскольку пищевые вещества, в отличие от лекарств, потребляются всеми людьми и постоянно.

У некоторых взрослых людей наблюдается постоянная непереносимость лактозы: молоко и молочные продукты вызывают у них газообразование в кишечнике, боли в животе и понос. Непереносимость обусловлена отсутствием в кишечнике фермента лактазы.

Лактаза содержится в кишечнике новорожденных и обеспечивает усвоение лактозы грудного молока, расщепляя ее на глюкозу и галактозу. Ко времени прекращения грудного вскармливания или немного позднее активность лактазы в кишечнике заметно снижается, а у некоторых детей исчезает полностью. Лактаза отсутствует примерно у 15 % взрослых людей европейских народностей и у 80 % восточных народностей, негров, индейцев Америки. Непереносимость наследуется как простой доминантный признак. Генетический дефект не связан с повреждением гена лактазы, поскольку в грудном возрасте фермент синтезируется. Очевидно, имеются аллеломорфы какого-то белка, участвующего во включении и выключении гена лактазы в ходе онтогенеза. Отметим, что молоко стало обычной пищей для взрослых лишь с того времени, когда человек научился разводить молочный скот; с этого времени и могло начаться распространение в популяциях аллеля, который обеспечивал сохранение лактазы у взрослых людей.

Рассмотренные здесь примеры непереносимости лекарственных или пищевых веществ представляют группу явлений того же рода, что и наследственная предрасположенность к болезням. Для диагностики наследственных болезней, обусловленных генными мутациями, часто используют ДНК-зонды, аналогично ДНК-диагностике серповидно-клеточной анемии, описанной в начале этой главы.

Международная исследовательская программа "Геном человека". Банки генетических данных. Биоинформатика. Митохондриальная ДНК и ДНК Y -хромосомы как объекты исследования в эволюционной и популяционной генетике.

ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА

Размеры генома человека

Напомним, что соматические клетки человека содержат диплоидный набор хромосом — 22 пары аутосомных и одну пару половых: XX — у женщин и XY — у мужчин, всего 46 хромосом. В яйцеклетках и сперматозоидах содержится гаплоидный набор — 23 хромосомы. Из них 22 хромосомы одинаковые у мужчин и женщин (аутосомные хромосомы), а 23-я хромосома X — у женщин и Y — у мужчин. Ауто-сомные хромосомы нумеруются от 1 до 22 в порядке уменьшения размера.

Общая длина всех молекул ДНК гаплоидного набора составляет 3*10⁹ н. п., или 1 м. Полная запись генома человека с использованием однобуквенных символов (AGCAAT...) заняла бы около 1000 томов по 1000 страниц каждый и 3000 знаков на странице. В каждой хромосоме содержится одна молекула ДНК. В хромосоме 21 (самая маленькая хромосома в геноме человека) молекула ДНК содержит 50 000 000 н. п., длина ее равна 1,5 см. Длина молекулы ДНК в хромосоме среднего размера равна примерно 130 000 000 н. п., или 4 см (в записи однобуквенными символами — 45 томов).

Небольшое количество ДНК содержится в митохондриях — меньше 1 % от всей ДНК. Митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии, поскольку митохондрии сперматозоидов не проникают в яйцеклетку

Геном Е. coli в 1000 раз меньше генома человека (один том однобуквенной записи).

Генами называют участки ДНК, кодирующие синтез тРНК, рРНК и мРНК. Гены, кодирующие синтез мРНК, называют также генами белков. На их долю приходится лишь около 10 % всей ДНК клетки (100 томов однобуквенной записи). Регуляторные последовательности занимают не много места. Функции остальной ДНК (почти 90 %) большей частью неизвестны; значительная часть ее представлена многократно повторяющимися, тандемно расположенными нукле-отидными последовательностями.

Для каждой из 60-ти индивидуальных тРНК имеется от 10 до 20 копий гена. Гены рРНК образуют тандемы повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие 28S-, 18S- и 5,8S- рРНК. Число таких повторов в геноме человека равно примерно 160-ти. Располагаются они в области ядрышковых организаторов пяти пар хромосом — 13, 14, 15, 21 и 22. Гены 5S-pPHK находятся на хромосоме 1, образуя тандем примерно из 2000 генов.

Число разных генов мРНК, т. е. генов, кодирующих разные белки, в клетках человека около 50 000. В гаплоидном наборе некоторые из индивидуальных генов мРНК представлены единственной копией, другие — двумя или несколькими копиями, и есть такие, число копий которых исчисляется сотнями (например, гены ги-стонов). Гены мРНК обычно имеют размеры в пределах 1000-1 000 000 н. п.

Библиотека ДНК человека

Одной из задач изучения генома является создание библиотеки ДНК человека. Под библиотекой ДНК подразумевают коллекцию клонированных (размноженных) фрагментов ДНК организма. Такими фрагментами могут быть гены, промоторы, энхансеры, сайленсеры и др. Одновременно создаются две формы библиотеки: 1) геномная библиотека, содержащая копии всех без исключения участков (нуклеотидных последовательностей) генома; 2) библиотека комплементарной ДНК, содержащая только те последовательности, которые комплементарны какой-либо из мРНК. Следовательно, эта библиотека не содержит регуляторных и других нетранскрибируемых последовательностей (напомним, что на их долю приходится около 90 % всей ДНК); кДНК не содержит также интронов. Полная библиотека генома человека является необходимой базой как для изучения функционирования генов, так и для решения прикладных проблем, прежде всего медицинских.

Технология рекомбинантных ДНК, конструирование химерных молекул ДНК и их клонирование. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) как методы изучения генома и диагностики болезней. Генная терапия.

Генная Инженерия.

Успехи биохимии привели к разработке методов, позволяющих манипулировать генами с целью изменения генотипа, а следовательно, и фенотипических признаков организма. Это направление исследований получило название генной инженерии. Основная цель таких исследований — научиться исправлять наследственные дефекты генома, т. е. лечить наследственные болезни, а также создавать этим методом новые фенотипы путем прямой пересадки генов из одного организма в геном другого. Первые успехи генной инженерии связаны с получением новых форм микроорганизмов, синтезирующих полезные для человека продукты, в том числе лекарственные вещества.

Процедура пересадки гена включает следующие операции:

1) выделение гена;

2) получение рекомбинантной (гибридной) ДНК;

3) введение рекомбинантной ДНК в клетку (получается рекомбинантная клетка);

4) клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК (рекомбинантных клеток).

Выделение гена.

Для выделения и клонирования (размножения) гена чаще всего применяют поли-меразную цепную реакцию (см. гл. 4). Еще один метод — синтез ДНК (гена) с использованием обратной транскриптазы. Напомним, что этот фермент есть в частицах некоторых РНК-содержащих вирусов. Обратная транскриптаза катализирует синтез ДНК, используя в качестве матрицы РНК:

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты -» ДНК + Н₄Р₂0₇

Если при реакции in vitro с этим ферментом добавить в инкубационную смесь определенную мРНК (например, мРНК интерферона), то синтезируется ген, комплементарный этой мРНК, в котором закодирована структура соответствующего белка (например, интерферона). Многие индивидуальные РНК удается выделить из сложной смеси разных мРНК клетки и использовать для синтеза генов. Однако при этом методе получается, собственно, не ген, а так называемая комплементарная ДНК (кДНК): она отличается от гена тем, что не содержит интронов, поскольку при созревании мРНК участки, соответствующие интронам, удаляются.

ДНК, синтезированную с применением обратной транскриптазы, можно амп-лифицировать методом ПЦР.

Получение рекомбинантной ДНК.

Ген нужно ввести в клетку таким образом, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, а интегрировался с геномом клетки. Для этого in vitro ген соединяют с определенной ДНК, выполняющей роль проводника (вектора). Часто в качестве вектора используют плазмиды — небольшие кольцевые молекулы ДНК, содержащие несколько генов. В исследованиях по генной инженерии часто используют кишечную палочку Е. coli. Геном этой бактерии представлен одной хромосомой (молекулой ДНК), прикрепленной к мембране, и плазмидами, «плавающими» в цитозоле. Плазмида представляет собой кольцевую ДНК; она примерно в 1000 раз меньше основной молекулы ДНК. В клетке может быть несколько разных плаз-мид, и каждая из них может быть представлена большим числом копий (до нескольких сотен). Репликация плазмид происходит независимо от репликации основного генетического материала. Некоторые плазмиды могут включаться в хромосому и снова отделяться от нее. Плазмиды могут переходить из одной бактериальной клетки в другую при конъюгации клеток.

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК. Для этого применяют рестрик-тазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются «липкие» концы — неспаренные участки цепей, способные присоединять комплементарные им полинуклеотиды. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, тоже создают «липкие» концы, используя ту же рест-риктазу, и, следовательно, на фрагменте ДНК образуются «липкие» концы, комплементарные «липким» концам рестриктированной плазмиды. Если теперь смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами. Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирную связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т. е. ДНК, содержащая новую комбинацию последовательностей (или генов), такую, какой прежде в природе не было.

Клонирование рекомбинантной ДНК.

Описанная выше процедура сложна и позволяет получать лишь очень небольшие количества рекомбинантной ДНК (рекомбинантных плазмид). Клонирование — это способ накопления, амплификации рекомбинантной ДНК.

Если к культуре Е. coli добавить рекомбинантные плазмиды, то они при определенных условиях включаются в бактериальные клетки — получаются рекомбинантные бактерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них — исследуемый фрагмент ДНК: для этого рекомбинантные плазмиды обрабатывают той же рестриктазой, с помощью которой они были созданы. Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей. Отметим, что этот результат вполне подобен результату, получаемому при использовании ПЦР: и в том и в другом случае происходит накопление исследуемой ДНК; по этой причине ПЦР часто называют молекулярным клонированием ДНК.

Применение рекомбинантных клеток для синтеза лек.средств.

Микроорганизмы — очень удобный объект для промышленного получения многих природных продуктов: они быстро размножаются (биомасса может удваиваться всего за полчаса), процессы выращивания и обработки биомассы технологичны, поддаются автоматизации. С развитием генной инженерии и техники рекомбинан-тных микроорганизмов появилась возможность заставить микроорганизмы синтезировать нужные человеку вещества, которые получить другими методами сложн.

Например, интерферон для применения в качестве лекарства прежде получали либо из лейкоцитов крови человека, либо из культуральной жидкости, в которой выращивают клетки человека, синтезирующие этот белок. Такие методы очень дороги и не позволяют получать достаточные количества лекарства.

Если ввести в клетки Е. coli плазмиду, содержащую ген интерферона человека, то они начинают продуцировать интерферон — белок, который природные штаммы бактерии не синтезируют. В настоящее время методами генной инженерии созданы также микроорганизмы, синтезирующие человеческие гормоны инсулин,

соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.

Амплификация (клонирование) фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции

Содержание ДНК в клетках невелико, а на долю одного фрагмента размером со средний ген приходится всего лишь около одной миллионной части всей ДНК клетки, и это создает значительные трудности для изучения генома. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет in vitro накопить необходимое количество исследуемого фрагмента ДНК. Метод основан на реакции синтеза ДНК при действии ДНК-полимеразы, но эта реакция организована особым образом.

Проведение полимеразной цепной реакции

Реакция проходит в три стадии.

1. Инкубационную смесь нагревают до 90 °С. При этом происходит денатурация ДНК, из одной двухцепочечной молекулы образуются две одноцепо-чечные.

2. Инкубационную смесь охлаждают до 50 °С. При этом происходит гибридизация цепей с затравками.

3. Инкубационную смесь нагревают до 70 °С. При этой температуре гибридные молекулы не денатурируются, а ДНК-полимераза удлиняет обе затравки с их З'-концов до 5'-концов матричных цепей. В результате образуются две новые цепи ДНК, укороченные с 5'-концов; при этом затравка оказывается включенной в эти укороченные цепи молекул ДНК.

Концентрация каждой затравки должна значительно превышать концентрацию ДНК. В противном случае во время стадии 2 высока вероятность того, что разделенные цепи ДНК будут соединяться не с затравкой, а друг с другом. Кроме того, как уже отмечено, затравки остаются в составе вновь синтезированной ДНК, т. е. расходуются во время реакции.

Затем цикл смены температур повторяют. Во втором цикле происходят те же события, что и в первом, но кроме того используются в качестве матриц укороченные цепи, образовавшиеся в первом цикле: эти цепи еще раз укорачиваются (с З'-концов), и образуются цепи, содержащие только последовательность нуклео-тидов искомого гена. В цикле 2 показаны превращения молекулы А, образовавшейся в цикле 1; аналогичным превращениям подвергается и молекула Б.

В следующем (третьем) цикле смены температур снова происходят те же события, что и в первых двух циклах, но кроме того используются в качестве матрицы цепи, содержащие только последовательность нуклеотидов искомого гена; в результате получается двухцепочечная молекула (выделена штриховкой), содержащая только ген данного белка.

Далее цикл смены температур повторяют многократно, и в каждом цикле (начиная с четвертого) происходит репликация гена, т. е. удвоение его количества в инкубационной смеси. Реакция протекает быстро, каждый трехстадийный цикл занимает около трех минут, за один час можно провести 20 циклов. Количество ДНК нарастает в геометрической прогрессии со множителем 2: за п циклов оно будет равно 2п; за 20 циклов увеличится примерно в миллион раз.

Поскольку матрица при матричном синтезе не расходуется, то исходная ДНК, внесенная в инкубационную смесь, в каждом цикле используется для синтеза укороченных с 5'-конца цепей. Количество этих матриц нарастает, однако не в геометрической, а в арифметической прогрессии, и через 20 циклов увеличивается примерно в 20 раз, что ничтожно мало по сравнению с миллионнократным увеличением количества гена.

Высокая эффективность ПЦР позволяет накопить необходимое количество ДНК при очень малых исходных количествах — достаточно одной капли крови, одного волоса, даже одной клетки или одной молекулы ДНК. Метод ПЦР резко ускорил изучение генома человека, и нашел практическое применение для диагностики болезней (ДНК-диагностика), а также для идентификации личности.

В частности, ПЦР применяют для диагностики инфекционных болезней. Традиционная диагностика таких болезней основана на использовании микробиологических методов, которые часто требуют гораздо больше времени и менее надежны, чем ДНК-диагностика. Метод основан на том, что первичная структура ДНК разных видов организмов различна. Следовательно, можно подобрать такие затравки, которые будут гибридизоваться с ДНК возбудителя, но не с ДНК человека. Если, используя эти затравки, провести ПЦР с материалом (кровь, биопсийный материал), полученным от больного, то нарастание количества ДНК в пробе будет указывать на наличие возбудителя в организме пациента: в ПЦР будет синтезироваться только ДНК возбудителя, а не пациента.

Вирусы, для которых характерен длительный латентный период (например, вирус иммунодефицита человека), трудно обнаружить на ранних стадиях развития инфекции. С помощью ПЦР это удается сделать даже тогда, когда вирус содержится лишь в незначительной части клеток организма.

Введение в обмен веществ. Биохимия питания