Применение ферментов для лечения болезней Виды энзимотерапии Принципы клеточной терапии.

 

Применение ферментов для лечения заболеваний. Высокая иммуногенность ферментов накладывает определенные ограничения на применение ферментов для лечения заболеваний. Однако на основе ферментов создан ряд эффективных лекарственных препаратов, который делится на две большие группы. Препараты первой группы (фестал, панкреатин, панзинорм, креон и т.п.) применяют в виде быстрорастворимых капсул, таблеток и других форм для облегчения пищеваре­ния в случае их недостаточности. Вторую группу составляют препараты, рас­считанные на поступление в кровяное русло (путем всасывания в кровь из тон­кого кишечника или инъекционно) и оказывающие системное регуляторное воз­действие на организм (препараты системной энзимотерапии).

Виды энзимотерапии. Развиваются следующие направления энзимотерапии:

1) заместительная терапия - применение ферментов в случае их недостаточно­сти и

2) энзимотерапия как составная часть комплексной (системной) терапии, т.е. применение в сочетании с другой терапией.

 

Применение ферментов как аналитических реагентов при лабораторной диагностике (определение глюкозы, этанола, мочевой кислоты и т.д.); Иммобилизованные ферменты. Представление об иммуноферментном анализе.

 

Ферменты используют как реагенты при определении концентрации метаболитов. В большинстве ферментативных анализов применяется спектрофотометрия, в основе которой лежит способность молекул поглощать свет в видимой или ультрафиолетовой области спектра.

Но ряд биомолекул не поглощает свет в указанных областях спектра. Кроме то­го, они присутствуют в смеси с другими соединениями, что затрудняет их опре­деление. Преодолеть эти трудности можно с помощью фермента, избирательно превращающего определяемый метаболит (или другое вещество, концентрация которого зависит от количества определяемого метаболита) в окрашенное веще­ство, концентрацию которого можно измерить по интенсивности поглощения света.

Для постановки диагноза и длительного мониторинга при сахарном диабете определяют содержание глюкозы в крови. Современный метод определения глюкозы в крови основан на двух последовательных реакциях:

1) - образование глюконолактона и пероксида водорода Н₂0₂ под действи­ем глюкозооксидазы (1.1.3.4.):

Глюкозооксидаза

глюкоза + 0₂ à глюконолактон + Н₂0₂

2) - окисление под действием фермента пероксидазы (1.11.1.7) бесцветного предшественника - реагента (I) передоксидом водорода в окрашенное зеленое соединение (II)                 

Пероксидаза

Реагент + Н₂0₂ àзеленое соединение + 2Н₂0

После того, как вся глюкоза прореагирует, количество окрашенного веще­ства определяют по светопоглощению, которое прямо пропорционально перво­начальному содержанию глюкозы в пробе.

Для определения концентрации мочевины в крови и моче используют фер­мент уреазу; различные дегидрогеназы применяются для определения соответ­ствующих субстратов - пирувата, лактата и др.

 

Иммуноферментный анализ. Метод основан на способности ферментов и ан­тител сохранять функциональную активность в составе комплекса антитело -фермент, а так же когда они связанны с молекулой носителем, т.е. представля­ют собой - иммобилизованные ферменты.

Метод иммуноферментного анализа используют для определения гормонов, онкомаркеров, лекарственных препаратов в крови больного, ферментов, иммуноглобулинов, бактерий, вирусов и антител против них.

Комплексы антитело - фермент обладают высокой специфичностью и чувстви­тельностью. Существуют различные модификации метода, основные - твердо­фазный и гомогенный.

Метод иммуноферментного анализа включает три стадии.

Первая стадия - образование иммунного комплекса (основная "специфическая стадия " процесса). На твердом носителе сорбирован антиген (Аг) любого ин­фекционного носителя (фрагмент вируса, бактерии, и т.д.). К нему добавляют исследуемый материал (сыворотку крови). Если в ней содержится антитело к инфекционному агенту, то они закрепляются на антигенах (Аг), образуя моле­кулярную цепочку.

На второй стадии добавляют готовый комплекс антитело - фермент (Ат2-Ф), который способен связываться с антителом человека Ат1, но не связывается с антигеном Аг. Затем происходит удлиннение молекулярной цепочки, включаю­щей в себя исследуемый белок-антиген, первые антитела, вторые антитела с иммобилизованным ферментом.

В третьей стадии процесса при добавления хромогена развивается цветная реак­ция. Степень окрашивания раствора прямо пропорциональна количеству иссле­дуемых белковых молекул.

Например, перспективным методом оценки тяжести острого панкреатита явля­ется определение в крови и кале методом иммуноферментного анализа пан­креатической эластазы, концентрация которой изменяется уже в первые 12 ча­сов от начала заболевания. Панкреатическая эластаза является абсолютно спе­цифичной для поджелудочной железы. Заместительная терапия ферментами поджелудочной железы не влияет на определение эластазы. Панкреатическая эластаза остается неизменной во время кишечного транзита. Таким образом, ее содержание в кале отражает состояние внешнесекреторной функции поджелу­дочной железы. Диагностику панкреатической внешнесекреторной недостаточ­ности проводят при хроническом панкреатите, холелитиазе, муковисцидозе, са­харном диабете, папиллярном стенозе, раке поджелудочной железы. Основными показаниями для назначения определения концентрации панкреатической эла­стазы в кале являются диагностика внешнесекреторной недостаточности подже­лудочной железы.

 

Биосинтез нуклеиновых кислот и белков (матричные биосинтезы)

Строение нуклеиновых кислот. Азотистые основания и сахара, входящие в состав ДНК и РНК. Нуклеозиды, нуклеотиды и полинуклеотиды. Связи, формирующие первичную структуру ДНК и РНК, 5'-фосфатный и 3'- гидроксильный концы полинуклеотидных цепей.

Знания о строении нуклеиновых кислот необходимы для понимания процес­са биосинтеза белков, механизмов наследственности и генетической изменчивос­ти организмов, происхождения и механизмов развития наследственных болезней.

Нуклеиновые кислоты — высокомолекулярные соединения. Молекулы ДНК имеют нитевидную форму. Длина молекул ДНК в клетках человека дос­тигает нескольких сантиметров (от 2 до 6 см). ДНК каждой хромосомы представ­ляет собой единую гигантскую молекулу. Вирусы и клетки бактерий часто содер­жат единственную молекулу ДНК. Молекулы РНК короче: их длина обычно не пре­вышает 0,01 мм.

Основная часть ДНК находится в ядре клетки, в составе хроматина; неболь­шое количество ДНК имеется в митохондриях (около 0,2 % от всей клеточной ДНК). РНК обнаруживается во всех частях клетки.

 

Нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры нуклеотидов. В свою оче­редь, нуклеотиды построены из трех компонентов: пиримидинового или пуринового основания, пентозы и фосфорной кислоты.

Соединение основания и пентозы называют нуклеозидом. Связь (бэта-гликозидная) образована первым атомом углерода пентозы с первым атомом азота в пиримидиновых нуклеозидах и девятым атомом азота — в пуриновых нуклеозидах.

 

Нуклеотиды представляют собой нуклеозидфосфаты, например уридиловая кислота (УМФ), дезоксиадениловая кислота (дАМФ). В клетках имеются также нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфаты.

В зависимости от природы пентозного остатка нуклеотиды делят на два типа: рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды.

Дезоксирибонуклеотиды в организме используются для образования ДНК. Функции рибонуклеотидов более разнообразны. Основная их масса расходуется на образование РНК. Кроме того, рибонуклеотиды выполняют роль коферментов в некоторых трансферазных реакциях (в частности, при синтезе полисаха­ридов). Адениловые рибонуклеотиды входят в состав коферментов НАД, НАДФ, ФАД, КоА. Уникальную роль в превращениях энергии в организме выполняет АТФ.

Все нуклеозидтрифосфаты, подобно АТФ, содержат две высокоэнергети­ческие связи, т. е. связи, при гидролизе которых освобождается значительное ко­личество энергии (около 50 кДж/моль); это связи между фосфатными остатками.

Пурины и пиримидины поглощают ультрафиолетовое излучение с длиной вол­ны около 260 нм. На этом основан метод определения концентрации нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

 

Мономеры в молекулах нуклеиновых кислот соединены сложноэфирной связью, образованной фосфатным остатком одного мононуклеотида и З'-гидроксильной группой пентозного остатка другого мононуклеотида (3',5'-фосфодиэфирная связь).

Межнуклеотидная 3',5'-фосфодиэфирная связь гидролитически расщепляется нуклеазами. Это большая группа ферментов, различающихся по специфичности. Есть нуклеазы, гидролизующие как РНК, так и ДНК, есть такие, которые расщеп­ляют только РНК (РНКазы) или только ДНК (ДНКазы). Одни из них отщепляют только концевые нуклеотиды (экзонуклеазы), другие гидролизуют внутренние связи (эндонуклеазы). Используя определенный набор нуклеаз, можно гидролизо-вать нуклеиновые кислоты до нуклеозидмонофосфатов — мономеров нуклеино­вых кислот. При этом в гидролизате РНК обнаруживается четыре типа рибонук-леозидмонофосфатов, а в гидролизате ДНК — четыре типа дезоксирибонуклео-зидмонофосфатов. Азотистые основания мономеров РНК и ДНК в трех случаях совпадают, а в одном — различны: УМФ (основание урацил) — в РНК, ТМФ (основание тимин) — в ДНК.

Таким образом, нуклеиновые кислоты представляют собой линейные полиме­ры нуклеозидмонофосфатов, полинуклеотиды. Концы полинуклеотида различа­ются по структуре: на одном конце имеется свободная 5'-фосфатная группа (5'-конец), на другом — свободная З'-ОН-группа (З'-конец).

Разные ДНК отличаются друг от друга числом мононуклеотидных остатков в молекуле, нуклеотидным составом и порядком чередования нуклеотидных остат­ков (фактически оснований, поскольку пентозофосфатные части у всех мономе­ров одинаковы). Так же отличаются друг от друга разные РНК. Для краткого изоб­ражения первичной структуры нуклеиновых кислот пользуются однобуквенными символами нуклеозидов: А — аденозин, G — гуанозин, С — цитидин, U — уридин, Т — тимидин. Первичная структура РНК может быть представлена, например, та­кой записью:

AUAAGUCCUA...

Запись структуры ДНК отмечается приставкой «д» (дезокси-):

д (СССАТАТТСА..)

Эти две записи, помимо символа «д», различаются еще тем, что в первой (РНК) не встречается символ Т, а во второй (ДНК) не встречается символ U.

При такой записи предполагается, что слева находится 5'-конец, справа — З'-конец. Иногда приходится писать полинуклеотиды противоположным образом; в этом случае во избежание путаницы вводят дополнительные приставки: (5'-3') AUAAG... — здесь 5'-конец слева; или (3'-5') GAAUA..., 5'-конец справа.

Из четырех разных нуклеотидов можно построить огромное количество нук­леиновых кислот, различающихся по первичной структуре. В этом отношении нуклеиновые кислоты сходны с белками.