Рецепты приготовления простых (основных) сред и изотонического раствора натрия хлорида.

Изотонический раствор натрия хлорида. К 1 л дистилли­рованной воды добавляют 9 г натрия хлорида. Раствор фильтру­ют, устанавливают заданный рН и, если нужно, стерилизуют при температуре 120 °С в течение 30 мин.

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5 % х.ч. натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10-15 мин для растворения веществ, устанавливают нужный ки­слотный показатель рН и снова кипятят 30-40 мин до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначального объема водой и стерилизуют 20 мин при температуре 120 °С.

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону (до стерили­зации или после нее) добавляют 2-3 % измельченного агар-агара и кипятят, помешивая, на слабом огне до; полного расплавления ага­ра. МПА можно варить в автоклаве или аппарате Коха. Готовую сре­ду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120 °С. Полужидкий агар содержит 0,4-0,5 % агар-агара.

Питательный желатин. К готовому бульону прибавляют 10-15 % желатина, подогревают до его расплавления (не кипятят!), разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром.

Рецепты приготовления сложных сред. Среды с углевода­ми. К основному бульону или расплавленному агару прибавляют нужное количество (0,1-2 %) определенного углевода (напри­мер, глюкозы). После его растворения разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром. Поскольку углеводы час­тично разрушаются даже при таком режиме стерилизации, пред­почтительнее 25-30 % раствор углеводов, стерилизованный через бактериальный фильтр, добавлять в нужном объеме с со­блюдением асептики к стерильным основным средам. После кон­троля стерильности среда готова к употреблению.

Среды с кровью готовят из стерильных простых сред, добав­ляя в асептических условиях (лучше в боксе) от 3 до 30 % (обычно 5 %) стерильной дефибринированной крови. Агаровые среды перед этим растапливают и остужают до 45 °С. При нужной температуре должно быть терпимое ощущение горячего, но не ожога. После до­бавления крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тща­тельно перемешивают и разливают в чашки или пробирки.

Разлив агаровых сред в чашки Петри.

Среды перед разли­вом расплавляют на водяной бане и остужают до 45-50 °С. Обычно для чашки диаметром 9 см достаточно 15-20 мл среды (высота слоя 0,25-0,3 см). Если слой выше, на нем менее контра­стно выглядят колонии. При очень тонком слое резко ограничено количество питательных веществ и влаги (среда быстро высыха­ет) – ухудшаются условия культивирования.

Разливают среды в стерильные чашки в асептических ус­ловиях. Чашки ставят крышкой вверх. Сосуд со средой берут в правую руку, держа его у огня. Левой рукой вынимают пробку, зажав ее мизинцем и ладонью. Обжигают горлышко сосуда и дву­мя пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. Вводят под нее горлышко флакона, не прикасаясь им к краю чашки. На­ливая среду, следят, чтобы она равномерно распределилась по дну чашки. Если при разливе на поверхности среды образуются пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, подносят пламя спички или горелки – пузырьки лопнут. Затем чашку за­крывают и дают среде застыть.

Когда посев производят в день разлива, среду необходимо подсушить. Для этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки открытой стороной вниз на 20-30 мин. Если посев производят на следующий день после разли­ва, чашки, не подсушивая, завертывают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали, и помещают в холодильник.

Приготовление скошенного агара.

Пробирки с 4-5 мл стерильной расплавленной агаровой среды укладывают в наклон­ном положении (примерно под углом 20 °С) с таким расчетом, что­бы среда не заходила за 2/3 пробирки, иначе она может смочить пробку, После того как среда застынет, пробирки ставят верти­кально — дают стечь конденсату. Лучше употреблять свежеско­шенный агар.

 

Вопросы для обсуждения.

1 Для культивирования каких организмов используют живые среды?

2 Какой компонент входит в большинство твердых культуральных сред?

3 Как проверяется стерильность приготовленной среды?

6 Как проверяются биологические (культуральные) свойства приготовленной среды?

7 Можно ли хранить приготовленные среды и каким образом?

8 Для каких исследований используются жидкие среды?