Культивирование микроорганизмов

Культивировать микроорганизмы – это значит искусственно созда­вать условия для их роста. В большинстве случаев в микробиологиче­ских лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стек­лянных колбах, пробирках и других сосудах. Для культивирования in vitro необходимы субстраты, которые микроорга­низмы могут использовать в качестве питательных веществ. Такие пита­тельные смеси – плотные или жидкие – называют культуральными сре­дами.

Среда – это твердая или жидкая субстанция, содержащая питательные вещества для культивирования (роста) микроорганизмов, а также клеток животных или тканей растений.

Культурой называют совокупность микробных клеток, растущих на среде (или в среде).

В зависимости от целей культивирования и видовой принадлежно­сти микроорганизмов консистенция и состав культуральных сред варьи­руют в широких пределах. Существуют следующие типы культуральных сред: природные, эмпириче­ски подобранные, синтетические и живые.

Эмпирически подобранные культуральные среды – это среды, применение которых основывается на опыте, а не на точных знаниях их состава и дей­ствия. На ранних этапах развития микробиологии широко применялись природные культураль­ные среды – молоко, моча, разведенная кровь, соки растений и т. п.

Среды можно специально приготовить из природных продуктов, напри­мер мясной или растительный бульоны и мясной настой. Такие среды широко применяются и в настоящее время. Они содержат богатый набор растворимых органических и неорганических соединений, в том числе все необходимые элементы и дополнительные вещества. Подобные среды удовлетворяют потребностям многих (но не всех) микроорганизмов; они удобны, дешевы и с успехом могут быть использованы в практической работе.

Синтетические культуральные среды. Современные культуральные среды явились результатом более точного изучения потребностей микро­организмов в питательных веществах; такие среды состоят из растворов химически чистых неорганических или органических соединений в точно установленных концентрациях. Эти среды находят специальное приме­нение в исследовательской работе и промышленности. Искусственные среды точно установленного воспроизводимого состава называются синте­тическими. Их применение возможно только при точном знании потребностей данного организма в питательных веществах.

Живые культуральные среды – это живые клетки (животные или растительные), выращиваемые в специальных питательных жидкостях. Большинство бактерий, дрожжей, плесеней, некоторые водоросли и про­стейшие можно культивировать на «мертвых» искусственных средах, т. е. на средах, не содержащих живых клеток. Хотя многие из этих микроорганизмов растут в контакте с живыми клетками, они способны расти и на «мертвых» средах. В этом отношении вирусы и риккетсии отличаются от всех упомянутых выше микроорганизмов: будучи облигатными паразитами, они не способны размножаться вне живых клеток – для их культивирования необходимы живые клетки.

По консистенции все среды делят на твердые и жидкие. Микроорганизмы можно выращивать на твердой среде или в жидкой среде (бульоне).

Твердые среды очень удобны для выращивания бактерий и грибов; их готовят путем смешивания жидкого питательного раствора с гелеобразующим компонентом (обычно агаром) в концентрации 1-2 %; при этом получается питательный агар. Агар представляет собой экстракт из красных водорослей. В концентрации 1-2 % агар плавится при 90-100 °С и застывает примерно при 44 °С. Агар можно предварительно простерилизовать нагреванием и затем остудить. Микроорганизмы рассевают по поверхности агара после его застывания, либо, если они выдерживают температуру около 44 °С, добавляют к агару непосредственно перед застыванием; тогда они равномерно распределяются по всей среде. Агар прозрачен и, будучи сложным полисахаридом, устойчив к разрушению микроорганизмами; это относится к его преимуществам. На твердых средах иногда выращивают и культуры тканей растений.

Жидкие среды часто используют для изучения роста популяции. Клетки помещают в пробирку, закрытую ватной пробкой или металлической крышкой, или в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой, такой как универсальный сосуд Маккартни, в который помещается около 25 см³ среды – как раз для заливки одной чашки. Перед тем, как среда будет использована для выращивания культуры клеток, она должна быть простерилизована. Добавление небольшого количества клеток к среде называется посевом (или инокуляцией). После инокуляции среду оставляют в термостате при оптимальной для роста данного микроорганизма температуре. Растущие клетки распределяются в среде случайным образом.

При использовании больших объемов среды культуру перемешивают, чтобы предотвратить оседание клеток. Для этой цели применяют механические встряхиватели или магнитные мешалки. Кроме того, пропускают стерильный воздух через среду, чтобы обеспечить поддержание оптимальной концентрации кислорода по всей среде. Для фильтрации воздуха и его стерилизации используют имеющиеся в продаже фильтры либо фильтры из стеклянной или неабсорбирующей хлопковой ваты. Воздух поступает через распылитель – устройство с множеством маленьких отверстий, позволяющее получать идеальные пузырьки. Его крепят на конце трубки, идущей ко дну сосуда с культурой. Жидкие культуры можно выращивать в виде периодических культур или непрерывных культур.

По назначению и действию на микроорганизмы культуральные среды делят на обогащенные, селективные, индикаторные.

Обогащенная среда – это среда, компоненты которой составлены таким образом, чтобы максимально удовлетворить потребности определенных микроорганизмов; таким образом им обеспечивается предпочтительный рост по сравнению с другими. При внесении в среду смешанной культуры, которую чаще всего выделяют из «природы», обычно растет преимущественно один или несколько типов микроорганизмов. Используя подходящую среду, можно избирательно выращивать нужный микроорганизм. Изменяя условия, такие как температура, рН, источник углерода и источник энергии, можно подобрать такую их комбинацию, которая максимально подходит для данного организма. К примеру, бактерии рода Salmonella, являющиеся возбудителями тифа (Salmonella typhi), выделяют и идентифицируют, помещая образцы пищи или фекалий в среду, содержащую селеновые производные (селен – элемент, по свойствам напоминающий серу). Обычные кишечные бактерии, например Еscherichia col i, которые тоже могут присутствовать в фекалиях, подавляются селеном. Обогащенная культура – один из наиболее мощных инструментов, используемых микробиологами для выделения микроорганизмов.

Селективная среда – это среда, в которую добавляются вещества, подавляющие рост всех организмов, за исключением одного или нескольких. Примером может служить добавление пенициллина к культуре с целью отбора устойчивых к нему организмов, или отбор гибридных клеток в процессе производства моноклональных антител.

Индикаторные среды содержат индикатор, который позволяет визуально отличать одни организмы от других. К примеру, определенные бактерии разрушают («сбраживают») сахар лактозу до кислоты. В среде, получившей название агар Макконки, которая содержит рН-индикатор нейтральный красный и желчные соли, колонии, сбраживающие лактозу, будут выглядеть красными, а не сбраживающие лактозу – бесцветными или бледно-розовыми. Этот метод используют, например, для выявления загрязнения питьевой воды сточными водами. Сточные воды содержат кишечные бактерии, такие как Еscherichia col i, которые сбраживают лактозу. Точно так же, если в образце кишечных бактерий присутствует Salmonella, то на агаре Макконки она будет образовывать бесцветные колонии.

В настоящее время широко применяются готовые среды.

Сухие среды, содержащие агар и все необходимые компоненты, имеются в продаже. Обычно их выдерживают 15 мин в воде и затем, чтобы простерилизовать, автоклавируют в колбах или флаконах в течение 15 мин при 121 °С. В процессе автоклавирования среда перемешивается и растворяется. Внутри автоклава под давлением кипит вода. Автоклав закрывается крышкой с защитным клапаном, выпускающим пар, когда достигнуто необходимое давление. Чем выше давление, тем выше температура кипения воды. Так стерилизуют растворы и оборудование, например, стеклянную посуду. Чтобы убить всех бактерий и их устойчивые споры, обычно достаточно 15-20 мин инкубации при давлении 103 кПа. При таком давлении температура внутри автоклава достигает 121 °С.