Эндоспоры и спорообразование.

Спорообразование – способ сохранения определенных видов бактерий в неблагоприятных условиях среды. Эндоспоры образуются в цитоплазме, представляют собой клетки с низкой метаболической активностью и высокой устойчивостью (резистентностью) к высушиванию, действию химических факторов, высокой температуры и других неблагоплиятных факторов окружающей среды. При световой микроскопии часто используют метод выявления спор по Ожешко. Высокая резистентность связана с большим содержанием кальциевой соли дипиколиновой кислоты в оболочке спор. Расположение и размеры спор у различных микроорганизмов отличается, что имеет дифференциально-диагностическое (таксономическое) значение. Основные фазы «жизненного цикла» спор – споруляция (включает подготовительную стадию, стадию предспоры, образования оболочки, созревания и покоя) и прорастание, заканчивающееся образованием вегетативной формы. Процесс спорообразования генетически обусловлен.

Некультивируемые формы бактерий

У многих видов грамотрицательных бактерий, не образующих спор, существует особое приспособительное состояние – некультивируемые формы. Они обладают низкой метаболической активностью и активно не размножаются, т.е. не образуют колоний на плотных питательных средах, при посевах не выявляются. Обладают высокой устойчивостью и могут сохранять жизнеспособность в течение нескольких лет. Не выявляются классическими бактериологическими методами, обнаруживаются только при помощи генетических методов (полимеразной цепной реакции – ПЦР).

Формы бактерий.

По форме выделяют следующие основные группы микроорганизмов:

1 Шаровидные или кокки (с греч.-зерно)

2 Палочковидные

3 Извитые

4 Нитевидные

5 Кокковидные бактерии (кокки) по характеру взаиморасположения после деления подразделяют на ряд вариантов:

1 Кокки;

2 Диплококки (от греч. diploos – двойной);

3 Стрептококки (лат. Streptococcus);

4 Тетракокки;

5 Сарцины (от лат. sarcina – связка, тюк – бактерии шаровидной формы диаметром 0,8-3 мкм);

6 Стафилококк (Staphylococcus от лат.– гроздь винограда).

 

Вопросы для обсуждения.

1 Перечислите обязательные органоиды бактериальной клетки.

2 Чем вызвано различное окрашивание грамположительных и грамотрицательных бактерий?

3 Какие принципы лежат в основе классификации бактерий?

4 Какие таксономические единицы используются в классификации бактерий?

5 Назовите современные методы идентификации бактерий.

Лабораторная работа № 5. Классификация и строение вирусов

Цель работы. Обобщить знания об особенностях организации, систематики и влиянии вирусов на жизнедеятельность человека. 

Задание. Определить особенности строения рассматриваемых групп микроорганизмов и их распространение, ответить на вопросы, записать определения выделенных в тексте терминов, сделать вывод о воздействии вирусов на человека и его хозяйственную деятельность.

Теоретическая часть

Вирусы (лат. virus – яд) – представляют собой минимальную форму жизни, по своей природе являются автономными генетическими элементами, имеющими внеклеточную стадию в цикле развития. Вирусы состоят из молекул нуклеиновых кислот – ДНК или РНК (некоторые, например мимивирусы, имеют оба типа молекул), заключённых в белковую оболочку.

Белковую оболочку, в которую упакован геном, называют «капсид». Наличие капсида отличает вирусы от вирусоподобных инфекционных нуклеиновых кислот – вироидов. Вирусы, за редким исключением, содержат только один тип геномной нуклеиновой кислоты. Классифицируют ДНК-содержащие вирусы и РНК-содержащие вирусы, на чём основана классификация вирусов по Балтимору.

Вирусы очень малы – их размеры колеблются в пределах от 20 до 300 нм (1 нм = 10^{-9 м). Практически все вирусы по своим размерам мельче, чем бактерии. Однако наиболее крупные вирусы, например вирус коровьей оспы, имеют такие же размеры, как и наиболее мелкие бактерии (хламидии и риккетсии), которые тоже являются облигатными паразитами и размножаются только в живых клетках. Поэтому отличительными чертами вирусов по сравнению с другими микроскопическими возбудителями инфекций служат не размеры или обязательный паразитизм, а особенности строения и уникальные механизмы репликации (воспроизведения самих себя).}

Ранее к вирусам также ошибочно относили прионы, однако впоследствии оказалось, что эти возбудители представляют собой особые инфекционные белки и не содержат нуклеиновых кислот.

Впервые существование вируса (как нового типа возбудителя болезней) доказал в 1892 году русский учёный Д. И. Ивановский. После многолетних исследований заболеваний табачных растений, в работе, датированной 1892 г., Д. И. Ивановский приходит к выводу, что табачная мозаика вызывается «бактериями, проходящими через фильтр Шамберлана, которые, однако, не способны расти на искусственных субстратах».

Пять лет спустя, при изучении заболеваний крупного рогатого скота, а именно – ящура, был выделен аналогичный фильтрующийся микроорганизм. А в 1898 г., при воспроизведении опытов Д. Ивановского голландским ботаником М. Бейеринком, он назвал такие микроорганизмы «фильтрующимися вирусами». В сокращённом виде, это название и стало обозначать данную группу микроорганизмов.

В 1901 г. было обнаружено первое вирусное заболевание человека – жёлтая лихорадка. Это открытие было сделано американским военным хирургом У. Ридом и его коллегами.

В 1911 г. Фрэнсис Раус доказал вирусную природу рака – саркомы Рауса (лишь в 1966 г., через 55 лет, ему была вручена за это открытие Нобелевская премия по физиологии и медицине).

В последующие годы изучение вирусов сыграло важнейшую роль в развитии эпидемиологии, иммунологии, молекулярной генетики и других разделов биологии. Так, эксперимент Херши-Чейз стал решающим доказательством роли ДНК в передаче наследственных свойств. В разные годы ещё как минимум шесть Нобелевских премий по физиологии и медицине и три Нобелевских премии по химии были вручены за исследования, непосредственно связанные с изучением вирусов.

В 2002 г. в Нью-Йоркском университете был создан первый синтетический вирус (вирус полиомиелита).

Известно огромное количество опасных заболеваний человека, вызываемых вирусами. Среди которых: СПИД, птичий грипп, натуральная (так называемая «черная») оспа, атипичная пневмония (SARS – severe acute respiratory syndrome, тяжелый острый респираторный синдром) и такие «рядовые» заболевания, как грипп, простуда, краснуха. Известно также несколько вирусов животных, способных инфицировать человека. Некоторые вирусы могут приобрести такую способность при определенных обстоятельствах, – например, ставший широко известным в последнее время вирус птичьего гриппа H5N1.

 

А

В
Рисунок 17 – А – вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД; В – вирус гриппа

 

Строение и формы вирусов.

Не имея клеточного строения, вирусы являются клеточными паразитами и способны жить и размножаться только внутри клеток других организмов, используя их ресурсы. Клетку, зараженную вирусом, принято называть клеткой-хозяином. Находясь во внешней среде, вирусные частицы способны только к сохранению и переносу находящейся в них генетической информации. Внеклеточную форму вируса принято называть вирионом.

Типичный вирус состоит из генетического материала, представленного в виде молекулы ДНК или РНК (ДНК и РНК вирусов при этом крайне разнообразны по строению – однонитевые и двунитевые, замкнутые в кольцо и т.д.) и упакованного в капсид – белковую оболочку, часто содержащую включения молекул липидов и углеводов. Внутри капсида могут находится необходимые для репликации вируса белки, такие как фермент обратная транскриптаза (RT, от reverse transcriptase), характерная для РНК-ретровирусов и необходимая для образования молекулы ДНК по матрице вирусной РНК в зараженной клетке-хозяине.

У простейших нитевидных или палочковидных вирусов белковые компоненты капсида связаны с нуклеиновой кислотой нековалентными связями, образуя спиральную нуклеопротеиновую структуру, называемую нуклеокапсидом (рисунок 18).

У многих вирусов капсид покрыт дополнительной оболочкой, называемой суперкапсидом или пеплосом, которая состоит из липидной мембраны зараженной клетки и вирусных белков. В пространстве между суперкапсидом и капсидом располагается белковый матрикс. Суперкапсид может иметь поверхностные выступы, называемые шипами или пепломерами. По наличию или отсутствию суперкапсида вирусы разделяют на два типа: оболочечные или покрытые вирионы (подавляющее большинство вирусов животных и человека) и безоболочечные или непокрытые вирионы.

 

 

Рисунок 18 – Схема строения вируса

 

Среди вирусов, лишенных оболочки, по форме капсидов различают три основных типа: палочковидные (нитевидные), сферические (икосаэдрические) и булавовидные (комбинированные). Палочковидные вирусы, такие как хорошо изученный вирус табачной мозаики, обладают спиральным типом симметрии: внутри белковой оболочки находится спиральная молекула РНК.

В капсидах сферических вирусов генетический материал не связан или слабо связан с белками оболочки. Капсиды вирусов этого типа нередко обладают икосаэдрическим типом симметрии. К вирусам сферического типа относятся, например, аденовирусы, вызывающие ОРВИ. Структура капсида аденовирусов имеет сложное строение: в вершинах икосаэдеров находятся кластеры белков - пентоны, содержащие в основании так называемые фибры – стержни с утолщениями на концах.

А                 Б

 

Рисунок 18 – А – частица бактериофага, показанная на схеме, имеет «головку» правильной геометрической формы и «хвост» со спиральной симметрией; Б – при икосаэдрическом типе симметрии, показанной на схеме строения аденовируса, капсомеры, или белковые субъединицы вируса, образуют изометрический белковый чехол, состоящий из 20 правильных треугольников

 

Вирусы, состоящие из структур различного типа (спиральных, икосаэдрических и дополнительных образований), относятся к булавовидному типу. К вирусам этого типа принадлежат некоторые вирусы бактерий, имеющие специальное название – бактериофаги или просто фаги (от греч. «фагос» – пожирающий). Бактериофаги этого типа состоят из икосаэдрической головки с молекулой ДНК или РНК внутри, примыкающей к спиральному хвосту, на конце которого имеется гексагональное плоское образование с хвостовыми отростками.

Механизм проникновения фагов в бактерии достаточно изучен. Фаг адсорбируется на клетке бактерии, затем содержимое головки фага (ДНК) переходит в бактерию, а оболочка фага остается вне ее. После заражения бактерия утрачивает способность к делению, перестает двигаться. Метаболизм бактериальной клетки перестраивается под влиянием ДНК фага таким образом, что она производит не вещества собственной клетки, а бактериофага. Затем клеточная стенка бактерии растворяется, и из нее выходят зрелые бактериофаги. При росте бактерий на питательном агаре, лизирующее действие бактериофага видно по образованию прозрачных зон, а на жидкой среде – по уменьшению мутности бактериальной суспензии.

Лизировать бактерии может только вирулентный фаг. Если бактерия инфицируется недостаточно активным бактериофагом, то гибели бактерий не наблюдается. Однако, при размножении бактерий патогенное начало вируса переходит в дочерние клетки. Бактериофаги такого действия называются умеренными, а бактерии-передатчики этих фагов – лизогенными. При определенных условиях лизогенные культуры бактерий могут быть лизированы находящимся в них фагом.

Вирусы бактерий – бактериофаги имеют наиболее сложный механизм доставки своего генетического материала в чувствительную бактериальную клетку. Сначала «хвост» фага, имеющий вид тонкой трубочки, прикрепляется к стенке бактерии. Затем специальные ферменты «хвоста» растворяют участок бактериальной стенки и в образовавшееся отверстие через «хвост», как через иглу шприца, впрыскивается генетический материал фага (обычно ДНК).

Систематика вирусов.

В вирусологии используются следующие таксономические единицы:

Семейство – название оканчивается на viridae;

Подсемейство – название оканчивается на virinae;

Род – название оканчивается на virus.

Таксономическая единица – вид вируса биноминального названия не имеет.

В основу классификации вирусов положены категории: тип нуклеиновой кислоты и ее структура, особенности воспроизводства вирусного генома, размер и морфология вириона, наличие суперкапсида, тип хозяина (растения, бактерии, насекомые, млекопитающие и т.д.), особенности вызываемой вирусами патологии (симптомы и характер заболевания), антигенные свойства вирусных белков и особенности реакции иммунной системы организма на внедрение вируса.

В систему классификации вирусов не вполне укладывается группа микроскопических возбудителей болезней, называемая вироидами (т.е. вирусоподобными частицами). Вироиды вызывают многие распространенные среди растений болезни. Это мельчайшие инфекционные агенты, лишенные даже простейшего белкового чехла (имеющегося у всех вирусов); они состоят только из замкнутой в кольцо одноцепочечной РНК.

Вирусные заболевания.

Хотя вирусы не являются полноценными живыми организмами, их эволюционное развитие имеет много общего с эволюцией других патогенных организмов. Для того чтобы сохраниться как вид, ни один паразит не может быть слишком опасным для своего основного хозяина, в котором размножается. В противном случае это привело бы к полному исчезновению хозяина как биологического вида, а вместе с ним и самого возбудителя. В то же время любой патогенный организм не сможет существовать как биологический вид, если у его основного хозяина слишком быстро и эффективно развивается иммунитет, позволяющий подавлять репродукцию возбудителя.

Поэтому вирус, вызывающий острое и тяжелое заболевание у какого-либо вида животных, обычно имеет еще и другого хозяина. Размножаясь в последнем, вирус не наносит ему (как виду) существенного вреда, однако такое относительно безвредное сосуществование поддерживает циркуляцию вируса в природе. Так, например, вирус бешенства в природе сохраняется среди грызунов, для которых заражение этим вирусом не является смертельным.

Природным резервуаром для вирусов лошадиных энцефалитов, особо опасных для лошадей и в несколько меньшей степени для человека, являются птицы. Эти вирусы переносятся кровососущими комарами, в которых вирус размножается без существенного вреда для комара. Иногда вирусы могут передаваться насекомыми пассивно (без размножения в них), однако чаще всего они репродуцируются в переносчиках.

Для многих вирусов, например, кори, герпеса и отчасти гриппа, основным природным резервуаром является человек. Передача этих вирусов происходит воздушно-капельным или контактным путем. Репродукция вирусов в природе поддерживается разными типами организмов: бактериями, грибами, простейшими, растениями, животными. Например, насекомые часто страдают от вирусов, которые накапливаются в их клетках в виде крупных кристаллов. Растения нередко поражаются мелкими и просто устроенными РНК-содержащими вирусами. Эти вирусы даже не имеют специальных механизмов для проникновения в клетку. Они переносятся насекомыми (которые питаются клеточным соком), круглыми червями и контактным способом, заражая растение при его механическом повреждении.

Более десяти основных групп вирусов патогенны для человека. Среди ДНК-содержащих вирусов это семейство поксвирусов (вызывающих натуральную оспу, коровью оспу и другие оспенные инфекции), вирусы группы герпеса (герпетические высыпания на губах, ветряная оспа), аденовирусы (заболевания дыхательных путей и глаз), семейство паповавирусов (бородавки и другие разрастания кожи), гепаднавирусы (вирус гепатита B). РНК-содержащих вирусов, болезнетворных для человека, значительно больше. Пикорнавирусы (от лат. pico – очень мелкий, англ. RNA – РНК) – самые мелкие вирусы млекопитающих, похожие на некоторые вирусы растений; они вызывают полиомиелит, гепатит А, острые простудные заболевания. Миксовирусы и парамиксовирусы – причина разных форм гриппа, кори и эпидемического паротита (свинки). Арбовирусы (от англ. arthropod borne – «переносимые членистоногими») – самая большая группа вирусов (более 300) – переносятся насекомыми и являются возбудителями клещевого и японского энцефалитов, желтой лихорадки, менингоэнцефалитов лошадей, колорадской клещевой лихорадки, шотландского энцефалита овец и других опасных болезней.

Реовирусы – довольно редкие возбудители респираторных и кишечных заболеваний человека – стали предметом особого научного интереса в силу того, что их генетический материал представлен двухцепочечной фрагментированной РНК.

Лечение и профилактика.

Репродукция вирусов тесно переплетается с механизмами синтеза белка и нуклеиновых кислот клетки в зараженном организме. Поэтому создать лекарства, избирательно подавляющие вирус, но не наносящие вреда организму, – задача чрезвычайно трудная.

К самым действенным элементам естественной защиты организма относятся специфические антитела (специальные белки, вырабатываемые иммунной системой), которые взаимодействуют с соответствующим вирусом и тем самым эффективно препятствуют развитию болезни; однако они не могут нейтрализовать вирус, уже проникший в клетку.

Организму можно помочь, усиливая выработку антител искусственно, в том числе создавая иммунитет заранее, с помощью вакцинации. Именно таким способом, путем массовой вакцинации, заболевание натуральной оспой было практически ликвидировано во всем мире.

Современные методы вакцинации и иммунизации разделяются на три основных группы. Во-первых, это использование ослабленного штамма вируса, который стимулирует в организме продуцирование антител, эффективно действующих против более патогенного штамма. Во-вторых, введение убитого вируса (например, инактивированного формалином), который тоже индуцирует образование антител. Третий вариант – так нназываемая «пассивная» иммунизация, т.е. введение уже готовых «чужих» антител. Животное, например лошадь, иммунизируют, затем из ее крови выделяют антитела, очищают их и используют для введения пациенту, чтобы создать немедленный, но непродолжительный иммунитет. Иногда используют антитела из крови человека, перенесшего данное заболевание (например, корь, клещевой энцефалит).

Накопление вирусов.

Для приготовления вакцинных препаратов необходимо накопить вирус. С этой целью часто используют развивающиеся куриные эмбрионы, которых заражают данным вирусом. После инкубирования зараженных эмбрионов в течение определенного времени накопившийся в них вследствие размножения вирус собирают, очищают (центрифугированием или другим способом) и, если нужно, инактивируют. Очень важно удалить из препаратов вируса все балластные примеси, которые могут вызывать серьезные осложнения при вакцинации. Конечно, не менее важно убедиться, что в препаратах не осталось неинактивированного патогенного вируса. В последние годы для накопления вирусов широко используют различные типы клеточных культур.

Методы изучения вирусов.

Вирусы бактерий первыми стали объектом детальных исследований как наиболее удобная модель, обладающая рядом преимуществ по сравнению с другими вирусами. Полный цикл репликации фагов, т.е. время от заражения бактериальной клетки до выхода из нее размножившихся вирусных частиц, происходит в течение одного часа. Другие вирусы обычно накапливаются в течение нескольких суток или даже более продолжительного времени. Незадолго до Второй мировой войны и вскоре после ее окончания были разработаны методы изучения отдельных вирусных частиц. Чашки с питательным агаром, на котором выращен монослой (сплошной слой) бактериальных клеток, заражают частицами фага, используя для этого его последовательные разведения. Размножаясь, вирус убивает «приютившую» его клетку и проникает в соседние, которые тоже гибнут после накопления фагового потомства. Участок погибших клеток виден невооруженным глазом как светлое пятно. Такие пятна называют "негативными колониями", или бляшками. Разработанный метод позволил изучать потомство отдельных вирусных частиц, обнаружить генетическую рекомбинацию вирусов и определить генетическую структуру и способы репликации фагов в деталях, казавшихся ранее невероятными. Работы с бактериофагами способствовали расширению методического арсенала в изучении вирусов животных. До этого исследования вирусов позвоночных выполнялись в основном на лабораторных животных; такие опыты были очень трудоемки, дороги и не очень информативны. Впоследствие появились новые методы, основанные на применении тканевых культур; бактериальные клетки, использовавшиеся в экспериментах с фагами, были заменены на клетки позвоночных. Однако для изучения механизмов развития вирусных заболеваний эксперименты на лабораторных животных очень важны и продолжают проводиться в настоящее время.

Вопросы для обсуждения.

1 Чем представлен наследственный материал вирусов?

2 Почему прионы не являются вирусами?

3 Чем отличается капсид и суперкапсид вирусов?

4 Какие морфологические группы вирусов выделяют?

5 Какие группы организмов поражают вирусы?

6 Назовите особенности воспроизводства вирусов.

7 Перечислите опасные вирусные заболевания.

8 Назовите особенности профилактики и лечения вирусных заболеваний. Чем это обусловлено?