Микрофлора организма человека

 

Цель: определить степень загрязненности кожи рук и предметов обихода. Описать микрофлору зубного налета, слизистой оболочки зева на основании данных микроскопического исследования.

Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри, стерильные пробирки, автоматические пипетки со стерильными наконечниками, стерильные ватные палочки, микробиологические петли, микроскоп, стекла предметные и покровные. Стерильная водопроводная вода или физраствор, агаризованная среда LB, реактивы для окраски по Граму, 70% этанол.

Основные положения

Микрофлора организма человека включает различные микроорганизмы, обитающие на кожных покровах, слизистых оболочках органов: ротовой полости, зева, носоглотки, верхних участков респираторного тракта, кишечника, особенно толстой кишки, и т.д. Одни из них являются постоянными (или облигатными) обитателями организма человека, другие - временными (факультативными или транзиторными). Среди последних нередко встречаются патогенные микроорганизмы.

Микрофлора кожи человека включает постоянных обитателей не поверхности (сарцины, стафилококки, некоторые виды стрептококков, грибов) и в глубоких слоях - в волосяных мешочках, просветах сальных и потовых желез (эпидермальыне стафилококки). Кроме характерной для кожи аутомикрофлоры, могут быть обнаружены транзиторные микроорганизмы, быстро исчезающие под влиянием бактерицидных, стерилизующих свойств кожи. Большей способностью к самоочищению обладает чисто вымытая кожа. Бактерицидность кожи отражает общую резистентность организма.

Следует понимать, что загрязнение лекарств микроорганизмами в процессе их приготовления возможно через грязные руки, содержащие аутомикрофлору, так и транзиторные микробы, способные вызвать порчу настоев, отваров и других препаратов.

В дыхательные пути вместе с воздухом попадают пылевые частички и микроорганизмы, треть которых задерживаются в носоглотке. Здесь чаще всего обнаруживаются анаэробные бактероиды, стафилококки, стрептококки, пневмококки. Трахеи и бронхи, как правило, стерильны.

Микрофлора желудочно-кишечного тракта наиболее обильна и разнообразна по видовому составу.

В полости рта обнаруживаются микроорганизмы более 100 видов, что объясняется наиболее благоприятными условиями существования: достаточная влажность, щелочная реакция среды, наличие остатков пищи, постоянная температура. В полости рта человека живут стрептококки стафилококки, лактобактерии, коринебактерии, спириллы и спирохеты, простейшие, грибы.

Микрофлора желудка очень скудна. Желудочный сок вызывает гибель микроорганизмов, попадающих в него с пищей, водой. При обследовании в содержимом желудка здорового человека можно обнаружить сарцины, дрожжи, молочнокислые бактерии.

 Бедна также микрофлора тонкого кишечника. Высокие отделы по характеру микрофлоры приближаются к желудку; в нижних отделах, постепенно обогащаясь, микрофлора сближается с флорой толстой кишки.

Микрофлора толстой кишки наиболее обильна и многообразна: в 1 г фекалий содержится до 250 млрд клеток. По современным представлениям, в составе микрофлоры толстого отдела кишечника здорового человека превалируют анаэробные бактерии, составляющие 96% всех видов кишечной аутофлоры. Основные представители: неспоровые грамположительные (бифидиум-бактерии, лактобактерии, пептококки, катенобактерии) и грамотрицательные палочки, среди которых основное место занимают бактероиды.

Значительная роль в микрофлоре кишечника принадлежит кишечной палочке E. coli - грамотрицательной, подвижной бактерии, обладающей энергичной ферментативной деятельностью. Кишечная палочка имеет выраженные антагонистические свойства против патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae, против стафилококков и грибов Candida. К представителям нормальной микрофлоры кишечника относятся энтерококки, или фекальный стрептококк, образующий цепочки из диплококков. Постоянно в кишечнике живут грибы, споровые анаэробы, спирохеты, простейшие, вирусы, включая фаги.

Качественный и количественный состав микрофлоры человека меняется в течение жизни и зависит от пола, возраста, питания и др. Кроме того, колебания в составе микробной флоры тела человека могут быть обусловлены возникновением заболеваний и применением химиотерапевтических и иммунологических средств, прежде всего антибиотиков. Оценка качественного и количественного состава микрофлоры организма человека по определенным показателям позволяет установить ее нарушения и связанные с ними последствия - дисбактериоз.

Для качественного изучения состава микрофлоры используют микроскопический и микробиологический методы исследования. Препараты-мазки готовят из зубного налета, смывов со слизистой оболочки зева, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Из зубного налета можно приготовить прижизненные препараты в "раздавленной" капле и микроскопировать их в темнопольном или фазово-контрастном микроскопе для обнаружения подвижных микроорганизмов.

Для микробиологического исследования берут определенный объем исследуемого материала (например, смывы из зева), разводят в изотоническом растворе хлорида натрия (в зависимости от предполагаемой концентрации) и делают посевы соответствующих разведений на питательные среды: для выявления гемолитических стрептококков или стафилококка - на кровяной агар, для выделения E. coli - на среду Эндо, для выделения грибов рода Candida - на среду Сабуро. Посевы производят таким образом, чтобы получить сосчитываемое количество колоний. Такие исследования повторяют через определенные сроки, чтобы сделать заключение о количественных изменениях в составе микрофлоры (особенно важно - в динамике заболевания).

Задания

1. Определить микрофлору зубного налета, слизистой оболочки зева.

Из зубного налета и смывов со слизистой оболочки зева готовят препараты мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Возможная микрофлора зубного налета представлена на рисунке 46.

Рисунок 46. Микрофлора зубного налета (по Л.В. Борисову и др. 1993): 1 – Leptotrichia buccalis; 2 – Lactobacillus sp.; 3, 4 – Treponema denticola, Treponema sp.; 5, 6 – стрептококки и диплококки (Streptococcus salivarius, S. maitis, S. sanguis, Veilonella sp.); 7 – Fusobacterium nucleatum.

 

2. Сделать смывы с кожи лица, рук, зубного налета, слизистой оболочки зева для установления состава и количества имеющихся там бактерий.

Для получения смывов стерильную ватную палочку смачивают стерильной водопроводной водой. Смоченной ватной палочкой делают смыв с рук обследуемого (грязные руки или вымытые и обработанные 70% спиртом): тыл кисти, поверхность ладони, межпальцевые пространства, ногтевые ложа. После окончания процедуры ватную палочку помещают в пробирку с 10 мл стерильной водопроводной воды и тщательно ее обмывают. Таким образом, получают исходное разведение. Из него готовят ряд последовательных десятикратных разведений (3-4). Затем из различных разведений смыва берут по 1 мл, вносят в стерильные чашки Петри, заливают расплавленной и остуженной агаризованной средой LB.Посевы выдерживают сутки при комнатной температуре, после чего производят подсчет выросших колоний.

Устанавливают количество микроорганизмов в 1 мл исходного разведения смыва (количество колоний, выросших на чашке, умноженное на степень разведения смыва). Определяют количество микроорганизмов в 10 мл смыва, соответствующее общему числу микроорганизмов, на той поверхности, с которой произведен смыв.

 

Контрольные вопросы

1.На какие группы подразделяют микрофлору человека?

2. Какие группы микроорганизмов обитают на кожи человека?

3. Чем опасны транзиторные микроорганизмы?

4. В чем особенность микрофлоры дыхательных путей?

5. Какие органы человека характеризуются обильной и разнообразной микрофлорой?

6. Какие особенностей полости рта обуславливают многообразие микрофлоры?

7. По каким причинам в желудке и тонком кишечнике микрофлора практически не обитает?

8. Дайте характеристику микрофлоры толстого кишечника.

9. От чего зависит качественный и количественный состав микрофлоры человека?

10. Какие методы используют для изучения качественного и количественного состава микрофлоры человека?

 

РАЗДЕЛ 10: ОСНОВЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

 

Лабораторная работа № 24

Серологические реакции

Цель работы: изучить иммунологические реакции с помощью реакций агглютинации, преципитации и бактериолизиса.

Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри, универсальная агаризованная питательная среда, стеклянный шпатель, горелки, пробирки, автоматические пипетки с наконечниками, иммунные сыворотки, антигены, физ. раствор.

 

Основные положения

Бактериолизис.

Одним из важнейших защитных свойств иммунной сыворотки при инфекции является ее способность растворять (лизировать) микроорганизмы или другие клеточные элементы, поступившие в организм. Специфические антитела, обусловливающие лизис клеток, называются лизины. Лизины способны проявлять свое лизирующее действие на антиген только в присутствии дополнительного фактора – комплемента. Комплемент является составной частью любой свежей сыворотки. (При хранении или подогревании сыворотки комплемент разрушается. Для обеспечения постоянства результатов иммунную сыворотку заранее инактивируют нагреванием при 56°С в течение 30 мин. и далее прибавляют к ней строго определенное количество комплемента).

Реакция бактериолизиса заключается в том, что при соединении иммунной сыворотки с соответствующими живыми бактериями в присутствии комплемента происходит лизис микробов (рис. 47).

 

Задание 1.

1. В опытной и контрольной пробирках делают смеси следующего состава:

- 200 мкл инактивированной иммунной сыворотки;

- 100 мкл взвеси культуры вибриона Мечникова (антиген);

- физиологический раствор - 1,7 мл в контрольной пробирке и 1,4 мл в опытной;

- 300 мкл комплемента в опытной пробирке.

2. Пробирки помещают на 1,5-2 часа в термостат при температуре 37 °С.

3. Подготовить чашки Петри с универсальной питательной средой.

4. Сделать посев 100 мкл смеси из каждой пробирки на чашки с агаром и поставить в термостат на сутки.

5. Рассмотреть результаты и сделать вывод по работе.

 

 

Рисунок 47. Бактериолизис на примере гемолиза эритроцитов

 

Реакция преципитации

Преципитацией называется явление осаждения антигена из раствора при воздействии на него иммунной сыворотки, содержащей антитела.

Внешнее проявление наступившей реакции преципитации выражается в следующем: при осторожном добавлении прозрачного жидкого антигена к иммунной преципитирующей сыворотке на границе обеих жидкостей появляется мутное кольцо, выпадающее в осадок. Эту реакцию часто называют кольцепреципитацией (рис. 48).

Рисунок 48. Кольцепреципитация

 

Реакция характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить минимальные следы белка – антигена (до разведения 1:100000 и выше).

Большое удобство в практике представляет особенность ряда бактериальных антигенов – их высокая резистентность к высокой температуре. На этом основана реакция термопреципитации по Асколи, когда антиген извлекают из исследуемого материала с помощью кипячения. Реакция Асколи применяется для идентификации сибиреязвенного, туляремийного, чумного антигена. Она нашла также применение в судебной медицине для определения видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фальсификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Недостатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав антигенов, участвующих в формировании преципитата.

Задание 2.

1. В узкую пробирку для преципитации налить 1 мл иммунной сыворотки на сибирскую язву.

2. При помощи пипетки медленно, по стенке пробирки налить 1 мл антигена (термофильтрат из шкур умерших животных). Жидкость спустить по стенке пробирки так, чтобы она не смешивалась с сывороткой, а образовала над ней верхний слой. (При положительном результате реакции сразу или в течение 5-10 мин. на границе обеих жидкостей образуется мутное кольцо от выпавшего в осадок антигена).

3.  Наблюдать образование кольца, сделать вывод по работе.

 

Реакция агглютинации.

Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток (корпускулярных антигенов) под действием специфических антител в присутствии электролитов (рис. 49).

Она применяется для серологической диагностики инфекционных заболеваний (реакция Видаля - при брюшном тифе и паратифах, реакция Вейгеля - при эпидемическом сыпном тифе, реакция Райта - при бруцеллезе и др.) и для серологической идентификации микробов.

 

Рисунок 49. Реакция агглютинации.

 

В реакции участвуют 3 ингредиента:

1) корпускулярный антиген (агглютиноген) в виде взвеси клеток;

2) антитело (агглютинин) в виде иммунной сыворотки;

3) изотопический раствор хлорида натрия (электролит).

Антигены - взвесь живых и убитых микроорганизмов.

Идентификацию вида (серотипа) микроба, выделенного от больного или внешней среды, определяют по известному антителу (диагностической иммунной сыворотки). Положительный результат реакции укажет на то, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления иммунной диагностической сыворотки.

Существует два основных метода постановки реакции:

1) ориентировочная - на предметном стекле, наступающая в течение нескольких минут. Применяется только с целью идентификации вида (серотипа) выделенной из организма больного чистой культуры по его специфичности как антиген к серотипу антитела;

2) развернутая - в пробирках, которая учитывается через 2 часа выдерживания при 37°С и на следующий день стояния при комнатной температуре. Применяется с целью идентификации микроба и обнаружения антител в сыворотке крови.

Реакции агглютинации входит в группу методов, в которых реакция протекает в две фазы:

1) соединение АГ с АТ (специфическая фаза);

2) выпадение образовавшегося комплекса АГ-АТ в растворе солей (электролите) в осадок (неспецифическая фаза).

Антигены поливалентны, а антитела - двух или более валентны. Соединение их приводит к образованию макроконгломератов, выпадающих в осадок. Причем характер осадка зависит от свойств антигена: жгутиковые бактерии склеиваются жгутиками, при этом образуются крупнохлопчатый осадок в течение двух часов при 37°С. У безжгутиковых бактерий происходит склеивание непосредственно самих клеток и образование мелкозернистого осадка. Такой осадок образуется медленно, в течение 18-24 часов при комнатной температуре.

Достоинства реакции является простота постановки и экспрессность. Недостаток - уступает по специфичности и чувствительности.

Задание 3.

Реакция Грубера

1. Подготовить 10 чистых пробирок.

2. Налить во все пробирки по 1 мл физ. раствора.

3. В первую и девятую пробирки налить 1 мл агглютинирующей сыворотки с разведением 1:50.

4. Со 2 по 8 пробирки провести серию разбавлений в 2 раза. В 10 пробирку сыворотку не добавлять.

5. В каждую пробирку добавить по 100 мкл антигена (диагностикум – взвесь убитых бактерий Salmonella typhi). В 9 пробирку антиген не добавлять.

6. Штатив с пробирками поместить в термостат на 2 часа при 37°С, а потом оставить на сутки при комнатной температуре.

7. Результаты опыта занести в таблицу, сделать вывод по работе.

 

Контрольные вопросы

1. Как называются специфические антитела, обусловливающие лизис клеток?

2. Как связаны лизины и комплемент?

3. В чем заключается реакция бактериолизиса?

4. Какой процесс называется преципитацией?

5. Чем характеризуется реакция преципитации? Ее преимущества и недостатки.

6. На чем основана реакция термопреципитации по Асколи? Для каких целей применяется реакция Асколи?

7. Дайте определение термину "агглютинация".

8. Для каких целей применяют реакцию агглютинации?

9. Какие ингредиенты участвуют в реакции агглютинации?

10. Какие иммунологические реакции применяют для идентификации серотипа?

11. Какие стадии выделяют в реакции агглютинации?

12. Какие достоинства и недостатки у реакции агглютинации?

 

Лабораторная работа № 25