Определение титра фаговых частиц

В случае если титр фага предположительно составляет 10¹⁰фаговых частиц в 1 мл, необходимо провести восемь десятикратных разведений исходной суспензии в стерильном физрастворе.

Агар для верхнего слоя (0,8 %), предварительно разлитый по 5 мл в пробирки, расплавляют и остужают в водяной бане до 48 °С. В таком состоянии агар можно хранить в водяной бане — 20 мин, так как при более продолжительном хранении он приобретает гелеобразную консистенцию. Готовят 2 пробирки (№ 1 и № 2). В каждую пробирку вносят 0,1 мл ночной бульонной культуры Е. со li.

В обе пробирки с мягким агаром и индикаторной культурой добавляют соответственно по 0,1 мл седьмого и восьмого разведений фаговой суспензии, тщательно перемешивают и выливают содержимое на чашку Петри с 1,5 %-м питательным агаром, равномерно распределяя по поверхности агара. После застывания верхнего слоя агара (10-15 мин) чашки переворачивают вверх дном и оставляют в термостате при 37 °С на ночь.

На следующий день считают количество негативных колоний на каждой чашке и определяют титр фага в исходном препарате с учетом фактора разведения и объема вносимого материала. Например, если при нанесении на чашку 0,1 мл фаговой суспензии при разведении 1 х 10⁷на этой чашке образовалось 150 стерильных пятен, то титр фаголизата будет равен (150х10)х10⁷ = 1,5 10¹⁰ частиц в 1 мл.

Контрольные вопросы

1. Что необходимо для выращивания бактериофагов?

2. Чему равен выход фага при выращивании?

3. От чего зависит период времени во время выращивания бактериофага?

4. Как определяют активность бактериофага?

5. В чем заключается метод агаровых слоев?

 

РАЗДЕЛ 9: САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

 

Лабораторная работа № 22

Микрофлора воздуха

 

Цель работы: изучить микрофлору воздуха учебных помещений методом оседания.

Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри, универсальная агаризованная питательная среда, горелки.

 

Основные положения.

Воздух не является средой обитания микроорганизмов, а является «транзитной» средой. Микрофлору условно делят на:

· постоянную;

· часто встречающуюся;

· переменную.

Постоянными представителями являются пигментообразующие кокки, палочки, спороносные бациллы, дрожжи, грибы и актиномицеты (т.е. микроорганизмы, устойчивые к свету и высыханию, когда влажность воздуха не высока).

В процессе практической работы микробиологу постоянно приходится учитывать присутствие микробов в окружающей среде. При исследовании бактериальной загрязненности воздуха учитывается общее количество микробов, содержащиеся в определенном объеме воздуха, и качественный состав микрофлоры воздуха (табл. 17).

Для микробиологического исследования воздуха используют 2 метода:

· седиментационный (по Коху) - оседание микробов под действием силы тяжести;

· аспирационный - основан на активном просасывании воздуха.

Методом оседания можно получить общее представление о встречающихся в воздухе микроорганизмах. Это наиболее простой способ изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определенное время(15-10мин), затем их закрывают, подписывают и выдерживают от 1 до 5 дней в термосе при температуре 26-28 °С.

Аспирационный метод позволяет определить как качественное, так и количественное содержание микроорганизмов в определенном объеме воздуха. Для реализации этого метода применяют аппарат Кротова (рис. 45), снабженный системой перекачки воздуха. Аппарат Кротова смонтирован в портативном ящике и состоит из узла для отбора проб воздуха, микроманометра и электромотора. Исследуемый воздух просасывают через клиновидную щель прозрачного диска, установленного на центробежном вентиляторе. Засасываемый воздух распределяется по поверхности питательной среды чашки Петри, помещенной на вращающемся устройстве.

Чашка со средой должна вращаться со скоростью 60 об/мин, что гарантирует равномерное распределение оседающих микроорганизмов по поверхности питательной среды. Скорость просасывания должна быть 25л/мин, время экспозиции 4-5мин.

Для выявления санитарно-показательных микроорганизмов посев производят на кровяной агар для обнаружения стрептококков и на молочно-солевой агар для обнаружения стафилококков. Из выросших колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Выделенную культуру идентифицируют по общепринятым методикам.

 

Рисунок 45. Внешний вид аппарата Кротова для бактериологического исследования воздуха: 1 – вентиль микроманометра; 2 – микроманометр; 3 – накидные замки; 4 – вращающийся диск; 5 – крышка; 6 – диск; 7 – клиновидная щель; 8 – корпус; 9 – основание.

 

Таблица 17. Нормы микробного числа

 

Наименование помещений	Санитарно-микробиологические показатели
	Общее количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха, (КОЕ/м3)
	до начала работы	во время работы
Операционные, послеоперационные палаты, реанимационные залы (палаты), в том числе для ожоговых больных, палаты интенсивной терапии, родовые, манипуляционные-туалетные для новорожденных	Не более 200	Не более 500
Послеродовые палаты, палаты для ожоговых больных, палаты для лечения пациентов в асептических условиях, в том числе для иммуннокомпрометированных.	Не более 500	Не более 750
Чистая и стерильная зоны (контроля, комплектования и упаковки чистых инструментов, помещения для подготовки перевязочных и операционных материалов и белья, стерилизации, экспедиции)	Не более 500	Не более 750
Процедурные и асептические перевязочные, процедурные бронхоскопии	Не более 300	Не нормируется
Воздух производственных помещений считается чистым	Не более 1500
Воздух жилых помещений считается чистым (по А.И.Шарифу)	Не более 1500 (летом) Не более 4500 (зимой)

 

Задания

1. Подготовить чашки с питательной средой.

2. Поставить открытые чашки в разных точках помещений для экспозиции на 5минут;

3. Закрыть чашки и поставить для культивирования на 3-5 дней при температуре 28 °С в термостат;

4. Рассчитать микробное число в воздухе по формуле:

Где Х- количество микроорганизмов в 1м³ воздуха;

а - количество колоний в чашке;

в - площадь чашки(78,5см²),

т - время экспозиции (5мин);

10 - объем воздуха, из которого происходит оседание микроорганизмов за 5мин (л);

100 - площадь, на которой происходит оседание (см²);

1000 - объем воздуха (л).

5. Результаты занести в таблицу 18. Сравнить полученные результаты с показаниями в таблице 17.

6. Сделать вывод.

 

Таблица 18. Результаты исследования микрофлоры воздуха.

Помещение	Количество микроорганизмов в 1м3 воздуха, Х

 

Контрольные вопросы

1. Как подразделяют микрофлору воздуха?

2. Что учитывают при исследовании бактериальной загрязненности воздуха?

3. Какие методы используют для микробиологического исследования воздуха? В чем они заключаются?

4. Как устроен аппарат Кротова? Для чего он применяется?

5. На какие питательные среды используют при анализе микрофлоры воздуха? Почему?

 

Лабораторная работа № 23