Выращивание Т-четных бактериофагов. Титрование фага

Методом агаровых слоев

 

Цель работы: получение суспензий фага Т4 при использовании бактерий Е. со li в качестве хозяина и определить титр полученных фагов

Материалы и оборудование: колба на 250мл со средой LB, ночная культура Е. со li, суспензия фага Т4, хлороформ, стерильные пробирки с 4,5 мл физраствором, агаризованная среда LB (0,8% и 1,5% агара), пустые пробирки, чашки Петри.

Основные положения

Получение фаговой суспензии с высоким титром требует определенного опыта работы с системой «фаг—клетка». При внесении небольшого количества фага в культуру чувствительных бактерий, активно размножающихся в жидкой питательной среде, частицы бактериофага адсорбируются на бактериальных клетках и после латентного периода лизируют их. Освободившееся в среду потомство частиц бактериофага заражает клетки, не вовлеченные в процесс инфекции, вызывая второй инфекционный цикл. Таким образом, последовательно заражаются все клетки суспензии, и процесс продолжается до тех пор, пока не произойдет лизис всех чувствительных бактерий. Теоретически выход фага равен численности популяций бактерий, умноженной на величину среднего выхода фага при лизисе клетки. Действительный выход часто меньше, так как некоторые из освободившихся вирусных частиц утрачиваются в результате повторной адсорбции на инфицированных, но не лизировавшихся бактериях или на обломках бактерий.

Период времени, необходимый для лизиса всех клеток, зависит главным образом от продолжительности латентного периода и числа введенных фаговых частиц. На процесс фаголизиса влияют также температура, степень аэрации, состав питательной среды, реакция среды и физиологическое состояние бактерий. Так, например, заражение бактериальной культуры в стационарной фазе не приводит к появлению фагового потомства.

В конце логарифмической фазы роста концентрация клеток в питательном бульоне составляет около 1х10⁹ в 1 мл. Если такую культуру заразить достаточным количеством фага (1х10⁹ фаговых частиц в 1 мл), то все бактерии инфицируются почти одновременно и лизис культуры наступит через 1 - 2 ч. При этом можно ожидать, что 10⁹ инфицированных бактерий в 1 мл могут дать 10¹¹ фаговых частиц в 1 мл, поскольку средний выход (для Т-четных фагов) составляет 100 - 200 фаговых частиц.

Для получения высокоочищенных фаговых суспензий применяют синтетические среды. С этой целью обычно используют аэрируемые колбы или бутыли, а также всевозможные ферментеры.

Активность бактериофага определяют по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или твердых средах и численно выражают степенью максимального разведения, в котором испытуемый фаг проявил свое литическое действие. Весьма точно активность бактериофага оценивается количеством инфекционных активных единиц в единице объема, т.е. определением титра бактериофага.

Для этой цели обычно пользуются методом агаровых слоев. Сущность метода состоит в том, что культуру индикаторных бактерий в «мягком» (0,8%-м) агаре при 48 ºС заражают фагом в соответствующем разведении. Эту смесь выливают на поверхность застывшего 1,5%-го питательного агара, дают застыть верхнему слою агара и ставят на инкубацию в термостат. В течение 6 - 12 ч бактерии размножаются внутри мягкого слоя агара в виде множества мелких колоний, получая питание из нижнего слоя 1,5%-гоагара, который применяют как основу. Низкая концентрация верхнего слоя агара создает пониженную вязкость, что способствует хорошей диффузии фаговых частиц. В результате фаговые частицы заражают бактериальные клетки, находящиеся в непосредственном соседстве с ними, размножаются и лизируют их. Фаговое потомство инфицирует затем соседние бактерии, которые в свою очередь подвергаются лизису в результате появления второго поколения фага, и т.д. В конечном итоге на растущем бактериальном газоне образуются прозрачные зона отсутствия роста бактерий — негативные колонии, стерильные пятна, или «бляшки». Образование каждого стерильного пятна может быть вызвано единственной частицей бактериофага. Следовательно, число негативных колоний может служить количественным показателем содержания инфекционных фаговых частиц в исследуемом растворе.

 

Задания

Выращивание фагов

В стерильный флакон на 250 мл вносят 30 мл питательного бульона (LB) и 3 мл ночной бульонной культуры Е. со li. Инкубационную смесь ставят на качалку при 37°С и аэрируют в течение 1,5 ч. После этого берут 3 мл для определения мутности культуры и установления точной концентрации бактерий.

Бактериальную суспензию заражают внесением суспензии фага с известным титром при множественности заражения 0,1 (отношение числа фаговых частиц к числу бактериальных клеток). Аэрацию инфицированных фагом клеток продолжают в течение 2 ч, затем добавляют несколько капель хлороформа для разрушения нелизированных бактериальных клеток и продолжают встряхивание в течение 15 мин.

Полученный лизат центрифугируют при 3 - 4 тыс. g в течение 20 мин для удаления обломков клеток и фагоустойчивых бактерий и хранят в холодильнике для дальнейшей работы.