Графоаналитический метод расчета условий непрерывного культивирования

Принцип метода состоит в сопоставлении графиков зависимости накопления биомассы от времени культивирования (см. рис. 21) с кривой продуктивности по выходу биомассы dx/ dt. Для этого в правой половине графика зависимости образования биомассы от времени культивирования (кривая X) наносят кривую зависимости продуктивности культуры по выходу биомассы от ее концентрации, т. е. dX/dt от X в тех же единицах оптической плотности (ед. ОП) (кривая ) (рис. 25).

Величина dX/dt рассчитывается по данным кривой роста.

Пример: Х₂ = 3 ед. ОП; Х₁= 1,5 ед. ОП, t₂ = 4,5 ч t₁ = 3,5 ч тогда dX/dt = 1,5 ед. ОП/ч.

 

 

Рисунок 25. Кривая роста культуры (Х) и кривая продуктивности по выходу биомассы .

 

На кривой зависимости продуктивности культуры находим точку, соответствующую максимальному значению dX/dt. При пересечении перпендикуляра с осью абсцисс находим точку, которая соответствует состоянию динамического равновесия при непрерывном культивировании dX/dt (например, 1,5 ед. ОП/ч). Проведя параллель по найденной точке до пересечения с осью ординат, находим показатель оптической плотности, соответствующий определенной концентрации биомассы X (например, 3 ед. ОП). Продлив эту прямую до пересечения с кривой роста, находим фазу роста, в которой будет поддерживаться культура. Опустив перпендикуляр на ось абсцисс со шкалой времени культивирования, находим время, необходимое для выхода культуры в нужную фазу роста и начала проточного культивирования. В стационарных условиях скорость протока (D) равна удельной скорости роста (μ). Их рассчитываем по формуле:

Таким образом, находим, что если при оптической плотности культуры, равной 3 в ферментере включить проток со скоростью 0,5 ч^-1, то производительность процесса получения биомассы будет максимальна. Культивирование будет осуществляться в режиме турбидостата.

 

Задания

Задание 1. Получение кривой роста культуры микроорганизмов

1. Выбрать вариант культивирования

Примерные варианты культивирования микроорганизмов представлены в таблице 4.

Таблица 4. Варианты культивирования микроорганизмов

№	Микроорганизм	Среда	Субстрат	Температура, °С	Режим аэрации, об/мин
1	E.coli K12	LB	-	28	180
2	E.coli K12	LB	-	37	180
3	Pseudomonas putida NF142	LB	-	28	180
4	Arthrobacter sp.BS2	LB	-	28	180
5	Gluconobacter oxidans	Среда G	сорбит	28	180
6	Pichia sp. 2518	Cреда Y	Глюкоза (10 г/л)	28	180
7	Pichia sp. 2518	Cреда Y	Глицерин (10 г/л)	28	180

Среды для культивирования

LB (Лурия – Бертрани): триптон - 10г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 10 г/л. Довести рН до 7,5.

Среда Y: (NH₄)₂SO₄ - 2,5 г/л, MgSO₄ - 0,2 г/л, K₂HPO₄x 3 H₂O - 0,7 г/л, NaH₂PO₄x 3 H₂O - 3 г/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, DL-лейцин - 0,17 г/л, глицерин – 8,3 мл/л (или глюкоза 10 гл), микроэлементы (ЭДТА-10г/л, ZnSO₄x 7H₂O - 4.4 г/л, MnCl₂ х 4H₂O - 1,01 г/л, CoCl₂ х 6H₂O - 0,32 г/л, CuSO₄ х 5H₂O - 0,315г/л, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ х 4H₂O - 0,22г, CaCl₂ х 2H₂O - 1,47 г/л, FeSO₄ х 7H₂O - 1 г/л) - 1 мл.

Среда G: D-сорбит - 200 г/л; Дрожжевой экстракт - 20 г/л; Дистиллированная вода - 100 мл; pH среды - 5,2-5,5

Для приготовления агаризованных сред к жидким средам добавить агара из расчета 16-20 г/л

2. Приготовить питательную среду для выращивания бактерий:

‑ приготовить среды согласно прописи;

– среду разлить в 3 ферментационные колбы по 100 мл;

– колбы плотно закрыть ватно-марлевыми пробками и стерилизовать автоклавированием 30 мин при 121°С;

– после автоклавирования колбы подписать (отметить микроорганизм, который будете засевать, дату, фамилию и номер колбы);

3. Засев инокулята:

‑ Засеять одну колбу для инокулята культурой и инкубировать (культивировать) в течение суток при заданных условиях;

‑ На следующий день засеять одну из колб, добавив 5-10 мл инокулята (инокулят хранить в холодильнике до засева второй колбы);

– Измерить исходную оптическую плотность культуры, для чего отобрать 2,5 мл культуры в отдельную пробирку и измерить оптическую плотность на спектрофотометре относительно воды при длине волны 590 нм;

‑ Вторую колбу засеять через 8 часов, добавив 5-10 мл того же инокулята, который добавляли в первую колбу;

4. Колбы установить на качалку с заданными параметрами температуры и аэрации.

5. Периодически (через 1-2 часа) производить отбор проб для измерения оптической плотности культуры.

6. Данные занести в табл. 5.

Таблица 5. Показатели роста культуры в ходе периодического культивирования

Дата	Время	Время от начала засева (колба 1), ч	Оптическая плотность А1, ед. (колба1)	Время от начала засева (колба 2), ч	Оптическая плотность А2, ед (колба2)

 

7. По результатам эксперимента построить кривые роста культур бактерий (оптическая плотность от времени культивирования и ln оптической плотности от времени), объединив значение полученные для первой и для второй колбы (время берут из таблицы 1 - время от начала засева по колбе 1 и 2).

8. Рассчитать параметры роста данной периодической культуры:

а) длительность фаз (по графику);

б) максимальную удельную скорость роста;

в) время генерации в экспоненциальной фазе роста;

9. Сделать вывод по работе.

Задание 2. Определение КОЕ

- приготовление материала

1. Приготовить 200 мл агаризованной питательной среды для выращивания бактерий.

2. Приготовить физ. раствор и разлить по 14 пробиркам по 4,5 мл.

3. Упаковать 6 чашек Петри.

4. Агаризованную среду, пробирки с физ. раствором и чашки Петри стерилизовать автоклавированием 30 мин при 121°С;

 

-отбор проб и высев

1. После засева колб отобрать 0,5 мл и добавить в одну из пробирок с 4,5 мл физ. раствора;

2. Приготовить 7 десятикратных разведений культуры;

3. Залить чашки Петри агаризованной средой и подсушить под УФ;

4. Сделать высев по 0,1 мл из соответствующих разведений;

5. Чашки Петри поместить в термостат крышками вниз для инкубации при температуре 28°С на 24 – 48 часов;

6. После завершения снятия кривой роста отобрать 0,5 мл культуральной жидкости, добавить в одну из пробирок с 4,5 мл физ. раствора и повторить п. 2-5.

7. Через 1-2 дня подсчитать число выросших на чашках Петри колоний и рассчитать содержание микроорганизмов (КОЕ/мл) в культуре на момент отбора проб:

где М – количество клеток в 1 мл;

  а – число колоний, выросших после посева из данного разведения; 

  V – объем суспензии, взятый для посева, мл;

  n – коэффициент разведения.

8. Сделать вывод по работе.

Задание 3. Построение кривой роста и расчет параметров роста по известным данным

1. Построить кривую роста культуры по показателям оптической плотности (табл. 5).

2. Рассчитать параметры роста данной периодической культуры:

а) длительность лаг-фазы (по графику);

б) максимальную удельную скорость роста;

в) время генерации в экспоненциальной фазе роста;

3. Используя данные табл. 6, рассчитать экономический коэффициент (выход биомассы от потребленного субстрата) для данной культуры.

Задание 4. Расчет параметров для непрерывного культивирования

1. Построить график зависимости удельной скорости роста от концентрации субстрата для данной культуры на основании данных табл. 7.

2. Рассчитать значение теоретической μ_max по формуле (5) при максимальном значении S (табл. 7).

3. По данным графика построенным в обратных координатах(1/μ от 1/S) определить:

а) значение константы Михаэлиса-Ментена (K_s);

в) значение практической максимальной скорости роста (μ_max).

4. Графоаналитическим методом рассчитать скорость протока для максимальной продуктивности культуры по выходу биомассы в единицах ОП (в режиме турбидостата), время культивирования в стационарных условиях и подключения подачи питательной среды (по вариантам 1-го этапа).

Контрольные вопросы

1. Какие два основных способа культивирования выделяют в зависимости от способа подачи питательных веществ и отбора получаемых продуктов?

2. Что называют периодическим культивированием? Чем характеризуется данный способ культивирования?

3. Что называют инокулятом?

4. Чем описывается рост микроорганизмов в периодическом режиме культивирования?

5. Какие фазы роста выделяют при периодическом культивировании микроорганизмов? Дайте характеристику каждой фазе роста.

6. Что называют непрерывным культивированием?

7. Как называют аппарат для непрерывного культивирования микроорганизмов?

8. Что характеризует скорость разбавления? Как рассчитать скорость разбавления?

9. Какие способы непрерывного культивирования выделяют в зависимости от контроля и управления процессами? Дайте характеристику этим способам?

10. Какие основные параметры роста периодической культуры анализируют? Как рассчитать эти параметры?

11. Какие параметры роста являются важными при непрерывном культивировании микроорганизмов?

12. Что характеризует величина K_s? Как ее определяют?

13. В чем заключается графоаналитический метод расчета условий непрерывного культивирования?

Таблица 5. Зависимость биомассы (Х), единицы оптической плотности (ОП) от времени культивирования (Т) на углеродном субстрате

№	Культура	Субстрат	Время культивирования, ч
			0	2	4	6	10	20	30	40	50	60	70	80
			Показания оптической плотности
1	Candida utilis	глюкоза	0,1	0,105	0,11	0,12	0,15	0,33	0,5	0,6	0,62	0,63	0,64	0,64
2	Rhococcus sp.	фенол	0,07	0,072	0,075	0,079	0,09	0,13	0,18	0,25	0,3	0,33	0,34	0,35
3	Pseudomonas sp.	метанол	0,085	0,087	0,09	0,096	0,12	0,19	0,27	0,34	0,39	0,42	0,43	0,44
4	Saccharomyces sp.	сахароза	0,1	0,102	0,105	0,109	0,12	0,17	0,23	0,31	0,38	0,44	0,47	0,48
5	Methylococcus sp.	пропионат	0,051	0,052	0,053	0,055	0,06	0,08	0,12	0,2	0,3	0,38	0,44	0,44
6	Cryptococcus sp.	маннит	0,05	0,053	0,058	0,066	0,087	0,15	0,22	0,285	0,34	0,36	0,36	0,36
7	Rhodopseudomonas capsulata	ацетат	0,05	0,053	0,064	0,078	0,112	0,2	0,31	0,43	0,49	0,5	0,5	0,5
8	Bacillus turing	глюкоза	0,05	0,05	0,06	0,1	0,2	0,5	0,73	0,81	0,86	0,88	0,88	0,88
9	Candida scotti	мальтоза	0,07	0,07	0,08	0,1	0,15	0,29	0,5	0,75	0,88	0,9	0,9	0,9
10	Mycobacterium sp.	каприловая кислота	0,06	0,061	0,065	0,072	0,095	0,16	0,24	0,28	0,31	0,33	0,33	0,33
11	Brevibacterium sp.	нафталин	0,03	0,032	0,035	0,039	0,048	0,1	0,17	0,3	0,45	0,5	0,53	0,55
12	Arthrobacter sp.	нафталин	0,06	0,06	0,062	0,064	0,069	0,083	0,098	0,15	0,34	0,52	0,57	0,57
13	Metilobacter sp.	метанол	0,02	0,02	0,023	0,031	0,05	0,16	0,3	0,46	0,58	0,65	0,68	0,7
14	Pseudomonas putida	капролактам	0,05	0,06	0,073	0,095	0,15	0,33	0,52	0,65	0,7	0,73	0,74	0,75
15	Pseudomonas putida	нафталин	0,103	0,104	0,106	0,11	0,13	0,21	0,35	0,52	0,62	0,68	0,7	0,7
16	Pichia angusta	глицерин	0,115	0,117	0,119	0,12	0,123	0,135	0,15	0,19	0,36	0,55	0,57	0,58
17	Pichia angusta	этанол	0,06	0,06	0,07	0,082	0,13	0,3	0,51	0,63	0,73	0,76	0,79	0,8
18	Gluconobacter oxidans	сорбит	0,017	0,019	0,025	0,029	0,04	0,08	0,15	0,28	0,5	0,8	0,88	0,9
19	Azotobacter sp.	Глюкоза + кадмий	0,018	0,018	0,018	0,019	0,025	0,04	0,06	0,13	0,27	0,4	0,42	0,42
20	Arthrobacter sp.	глюкоза + кадмий	0,02	0,02	0,02	0,023	0,06	0,19	0,31	0,4	0,42	0,44	0,45	0,45
21	Eschericia coli	глюкоза	0,03	0,03	0,03	0,033	0,05	0,1	0,18	0,33	0,45	0,5	0,5	0,5
22	Pseudomonas sp.	капролактам	0,05	0,05	0,05	0,052	0,055	0,068	0,095	0,18	0,35	0,45	0,48	0,48
23	Brevibacterium sp.	нафталин	0,11	0,11	0,114	0,12	0,135	0,2	0,3	0,45	0,7	0,9	0,95	0,95
24	Arthrobacter sp.	нафталин	0,08	0,082	0,084	0,087	0,096	0,124	0,25	0,65	0,87	0,9	0,92	0,94
25	Arthrobacter sp.	Нафталин + 5%NaCl	0,014	0,015	0,018	0,026	0,045	0,13	0,24	0,41	0,57	0,7	0,75	0,77
26	Eschericia coli	маннит	0,008	0,01	0,01	0,012	0,02	0,06	0,21	0,52	0,7	0,84	0,85	0,85
27	Candida sp.	глицерин	0,108	0,11	0,112	0,12	0,15	0,25	0,4	0,7	0,95	1,18	1,2	1,2

Таблица 6. Выход биомассы, начальная концентрация субстрата в среде и остаточные концентрации в культуральной жидкости

№	Культура	Субстрат	Биомасса, ед. ОП (Х)	Начальная концентрация субстрата в среде, мг/л (S)	Остаточная концентрация субстрата в культуральной жидкости, мг/л (S0)
1	Candida utilis	Глюкоза	500	1000	100
2	Rhococcus sp.	Фенол	200	500	50
3	Pseudomonas sp.	Метанол	100	250	20
4	Saccharomyces sp.	Сахароза	500	2000	1000
5	Methylococcu ssp.	Пропионат	300	2000	900
6	Cryptococcus sp.	Маннит	550	1000	150
7	Rhodopseudomonas capsulata	Ацетат	480	2000	800
8	Bacillus turing	Глюкоза	540	1000	80
9	Candida scotti	Мальтоза	400	1000	100
10	Mycobacterium sp.	Каприловая кислота	200	1000	500
11	Brevibacterium sp.	Нафталин	500	1000	100
12	Arthrobacter sp.	Нафталин	450	1000	100
13	Metilobacte rsp.	Метанол	200	500	30
14	Pseudomonas putida	Капролактам	500	2000	20
15	Pseudomonas putida	Нафталин	350	1000	100
16	Pichia angusta	Глицерин	500	1500	50
17	Pichia angusta	Этанол	450	1000	80
18	Gluconobacter oxidans	Сорбит	350	1000	120
19	Azotobacter sp.	Глюкоза+кадмий	200	1000	200
20	Arthrobacter sp.	Глюкоза + кадмий	100	1000	250
21	Eschericia coli	Глюкоза	300	1000	20
22	Pseudomonas sp.	Капролактам	300	1000	50
23	Brevibacterium sp.	Нафталин	540	1000	100
24	Arthrobacter sp.	Нафталин	400	1000	120
25	Arthrobacter sp.	Нафталин+5%NaCl	200	1000	200
26	Eschericia coli	Маннит	500	2000	300
27	Candida sp.	Глицерин	450	1500	100

Таблица 7. Зависимость удельной скорости роста культур (µ) от концентрации субстрата (S)

№	Культура	Субстрат	параметры
1	Candida utilis	глюкоза	S мг/л	20	40	80	120	160	200	300
			μ ч-1	0,2	0,3	0,4	0,43	0,46	0,47	0,47
2	Rhococcus sp.	фенол	S мг/л	100	140	160	240	600	800	1000
			μ ч-1	0,07	0,09	0,1	0,13	0,19	0,2	0,2
3	Pseudomonas sp.	метанол	S мг/л	10	20	30	40	50	60	80
			μ ч-1	0,3	0,5	0,6	0,75	0,82	0,85	0,9
4	Saccharomyces sp.	сахароза	S мг/л	50	100	150	200	300	400	500
			μ ч-1	0,06	0,1	0,12	0,15	0,18	0,19	0,2
5	Methylococcus sp.	пропионат	S мг/л	50	100	150	200	300	400	500
			μ ч-1	0,04	0,08	0,12	0,15	0,2	0,23	0,24
6	Cryptococcus sp.	маннит	S мг/л	20	40	60	80	100	120	140
			μ ч-1	0,05	0,1	0,15	0,2	0,23	0,24	0,25
7	Rhodopseudomonas capsulata	ацетат	S мг/л	10	20	30	40	50	60	80
			μ ч-1	0,02	0,04	0,06	0,08	0,1	0,12	0,13
8	Bacillus turing	глюкоза	S мг/л	20	40	60	80	100	120	140
			μ ч-1	0,05	0,08	0,1	0,11	0,115	0,12	0,12
9	Candida scotti	мальтоза	S мг/л	50	100	150	200	300	400	500
			μ ч-1	0,05	0,07	0,09	0,1	0,11	0,12	0,12
10	Mycobacterium sp.	каприловая кислота	S мг/л	10	20	30	40	50	60	80
			μ ч-1	0,04	0,07	0,1	0,13	0,16	0,18	0,19
11	Brevibacterium sp.	нафталин	S мг/л	20	35	45	55	70	85	100
			μ ч-1	0,15	0,25	0,3	0,35	0,39	0,42	0,45
12	Arthrobacter sp.	нафталин	S мг/л	10	20	35	50	65	75	90
			μ ч-1	0,04	0,07	0,1	0,12	0,13	0,13	0,13
13	Metilobacter sp.	метанол	S мг/л	20	80	150	200	300	400	500
			μ ч-1	0,02	0,08	0,14	0,18	0,21	0,24	0,25
14	Pseudomonas putida	капролактам	S мг/л	5	15	30	40	50	60	80
			μ ч-1	0,06	0,15	0,23	0,26	0,28	0,29	0,3
15	Pseudomonas putida	нафталин	S мг/л	10	25	60	80	100	120	140
			μ ч-1	0,1	0,22	0,4	0,45	0,48	0,49	0,5
16	Pichia angusta	глицерин	S мг/л	25	50	75	100	125	150	175
			μ ч-1	0,03	0,05	0,07	0,09	0,1	0,105	0,11
17	Pichia angusta	этанол	S мг/л	30	110	190	260	340	420	500
			μ ч-1	0,03	0,11	0,17	0,21	0,23	0,24	0,25
18	Gluconobacter oxidans	сорбит	S мг/л	20	65	115	160	205	250	300
			μ ч-1	0,1	0,23	0,31	0,38	0,42	0,44	0,45
19	Azotobacter sp.	глюкоза + кадмий	S мг/л	20	50	80	110	140	170	200
			μ ч-1	0,04	0,08	0,1	0,115	0,12	0,126	0,13
20	Arthrobacter sp.	глюкоза + кадмий	S мг/л	10	20	35	50	65	75	90
			μ ч-1	0,05	0,1	0,17	0,2	0,23	0,24	0,25
21	Eschericia coli	глюкоза	S мг/л	10	20	35	45	55	65	80
			μ ч-1	0,08	0,16	0,28	0,35	0,38	0,42	0,43
22	Pseudomonas sp.	капролактам	S мг/л	20	50	75	125	150	175	200
			μ ч-1	0,2	0,42	0,56	0,64	0,67	0,68	0,7
23	Brevibacterium sp.	нафталин	S мг/л	10	30	60	85	105	125	150
			μ ч-1	0,12	0,3	0,49	0,56	0,57	0,59	0,6
24	Arthrobacte rsp.	нафталин	S мг/л	20	65	115	160	205	250	300
			μ ч-1	0,02	0,05	0,08	0,09	0,1	0,11	0,11
25	Arthrobacte r sp.	нафталин + 5%NaCl	S мг/л	20	65	115	160	205	250	300
			μ ч-1	0,02	0,054	0,1	0,12	0,13	0,14	0,14
26	Eschericia coli	маннит	S мг/л	50	125	200	275	350	425	500
			μ ч-1	0,05	0,11	0,14	0,17	0,18	0,19	0,2
27	Candida sp.	глицерин	S мг/л	30	100	170	240	310	380	450
			μ ч-1	0,07	0,16	0,22	0,27	0,31	0,33	0,34

РАЗДЕЛ 5: МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ

 

Лабораторная работа № 13