Исследование микроорганизмов в живом состоянии

 

Цель работы: исследовать живые клетки микроорганизмов методами раздавленной и висячей капли.

Материалы и оборудование: пробирки (или чашки Петри) с культурами бактерий, микробиологические петли, предметные стекла, предметные стекла с лункой, покровные стекла, краситель нейтральный красный или метиленовый синий (0,0001%), микроскоп, спиртовки.

 

Основные положения

Исследование микроорганизмов в живом состоянии применяют для выявления их подвижности, наблюдения за размножением, образованием и прорастанием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, определения запасных веществ в клетке.

Изучение микробов проводят в неокрашенном состоянии или используют «прижизненные» - витальные – красители. Прижизненными красителями являются метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001%.

Недостатками метода являются:

1) трудность исследования неокрашенных микроорганизмов ввиду плохой преломляемости света;

2) невозможность длительно сосредоточить внимание на микробе, т.к. он быстро перемещается из поля зрения.

После микроскопии живых патогенных микроорганизмов мазки обязательно помещают в дезинфицирующий раствор.

В живом состоянии микроорганизмы исследуют методами раздавленной и висячей капли.

 

Метод раздавленной капли

На чистое предметное стекло наносят каплю воды и исследуемого материала, перемешивают. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха. Для этого покровное стекло берут за грани, ставят на ребро рядом с каплей и осторожно опускают, не допуская образования пузырьков воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному и удаляют избыток воды фильтровальной бумагой, поднося ее к краям покровного стекла. Жидкость должна заполнять все пространство между стеклами, но не выступать за края покровного стекла.

На покровное стекло наносят каплю кедрового масло и просматривают препарат под микроскопом с иммерсионным объективом.

Метод удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, изучении запасных веществ клетки и просмотра крупных объектов – микроскопических грибов и дрожжей.

 

Метод висячей капли

Требуется специальное предметное стекло с лункой посередине (рис. 12.1). На обезжиренное покровное стекло наносят каплю исследуемого материала (рис. 12.2). Покровное стекло накрывают предметным, так чтобы капля была в центре лунки предметного стекла (рис. 12.3). Предметное стекло быстро поворачивают каплей вниз (рис. 12.4). Капля должна свободно свисать в углубление, не соприкасаясь с его дном и краями. Края выемки на предметном стекле предварительно смазывают вазелином. Таким образом, капля оказывается герметически закрытой во влажной камере и защищенной от высыхания.

Рисунок 12. Приготовление препарата висячая капля

Задания:

1. Приготовить препарат исследуемой культуры методом раздавленной капли, окрасив его нейтральным красным (0,0001%) для лучшего изучения под микроскопом.

2. Рассмотреть препарат под микроскопом с иммерсионным объективом, отметить морфологическую форму и способность бактерий к движению, зарисовать.

3. Приготовить препарат исследуемой культуры методом висячей капли, окрасив нейтральным красным (0,0001%).

4. Рассмотреть препарат под микроскопом с иммерсионным объективом, отметить морфологическую форму и способность бактерий к движению, зарисовать.

5. Сделать вывод по работе.

Контрольные вопросы

1. Для каких целей исследуют микроорганизмы в живом состоянии?

2. Какие красители относят к витальным?

3. Каковы недостатки методов исследования микроорганизмов в живом состоянии?

4. Какие методы исследования микроорганизмов в живом состоянии выделяют?

 

Лабораторная работа № 7

Споры бактерий

 

Цель работы: освоить технику окрашивания спор у бактерий.

Материалы и оборудование: пробирки с культурами спорообразующих бактерий, микробиологические петли, предметные стекла, красители - метиленовый синий Леффлера, нейтральный красный (0,5%), микроскоп, спиртовки.

Основные положения

Для многих бактерий характерно образование эндогенной споры. Споры образуются при неблагоприятных внешних условиях существования бактерий (высыхание, недостаток питательных веществ, неблагоприятная температура, наличие вредных продуктов обмена и др.). Они представляют собой округлые, овальные или эллипсовидные образования. По мере образования споры клетка постепенно отмирает. Но в благоприятных условиях спора вновь прорастает в вегетативную форму. Спора является защитным приспособлением для сохранения вида в измененных условиях среды, она чрезвычайно стойка и требует специальных способов окраски.

Спорообразование присуще бациллярным формам, но не коккам и спириллам. Если диаметр споры не превышает диаметра клетки, в которой спора образуется, клетку называют бациллярной (рис. 13). В бациллярной клетке спора может располагаться:

1) центрально (палочка сибирской язвы);

2) на конце - терминально (палочка столбняка);

3) ближе к одному из концов - субтерминально (палочка ботулизма).

Если спора превышает диаметр клетки, то в зависимости от ее расположения:

- в центре – клетку называют клостридиальной (рис. 14);

- на конце клетки – плектридиальной.

 

Рисунок 13. Расположение эндоспор: 1 - бациллярное центральное, 2 - бациллярное терминальное, 4 – клостридиальное, 3 и 5 - плектридиальное

 

Рисунок 14. Клостридии: А – Clostridium tetani (барабанные палочки);

Б – Clostridium р erfringens; B – Clostridium botulinum (теннисные ракетки)

Споры с трудом вступают в физико-химические реакции с различными веществами, в т.ч. и красками. Поэтому в препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, споры остаются бесцветными.

Все способы окраски спор основаны на едином принципе: сначала споры протравливают различными веществами: хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, гидроксидом натрия, перекисью водорода (для размягчения оболочки), затем окрашивают клетку со спорой при нагревании и, далее, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастным красителем.