Образующаяся в результате переаминирования щавелевоуксусная кислота декарбоксилируется при помощи анилинцитрата и превращается в ПВК. Последнюю определяют в виде 2,4-динитрофенилгидразина. Поскольку реакционная смесь содержит a-кетоглутаровыую кислоту, которая в этих же условиях образует соответствующий гидразон с 2,4-динитрофенилгидразином, пробу экстрагируют толуолом. В толуол переходит только гидразон ПВК, а гидразон a-кг остается в водном растворе. При добавлении к толуоловому экстракту спиртовой щелочи развивается стабильное красно-орнажевое окрашивание. Интенсивность которого пропорциональна концентрации ПВК,. Определяют колориметрически на ФЭКе.
Ход работы. В центрифужную пробирку внести 0,1 мл прединкубированной сыворотки крови, в другую – контрольную 01, мл дистиллированной воды. В обе пробирки вносят по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина. Инкубируют 20 минут при комнатной температуре. Затем добавляют по 0,5 мл 0,4 N NаОН. Окраску проб колориметрировать на ФЭКе с зеленым светофильтром в кюветах 10 мм против контрольной пробы.
Активность АСТ и АЛТ вычисляют при помощи калибровочных кривых.
Норма активности АСТ- 0,1-0,45 ммоль / ч.л
АЛТ – 0,1-0,68 ммоль / ч.л
Результат:
Вывод:
Домашнее задание
Решите ситуационные задачи и ответьте на вопросы
1. При циррозе печени часто наблюдаются нарушения функций центральной нервной системы: снижение памяти, нарушение ориентировочных и поведенческих реакций. Накопление какого метаболита в нервной ткани может быть причиной таких расстройств?
2. При дефиците витамина В6 у детей возникают судороги, которые довольно быстро исчезают при парэнтеральном введении пиридоксина. Имеется ли связь между дефицитом витамина В6, нарушением метаболизма аминокислот и возникающими судорогами?
3. В эксперименте на животных обнаружено, что в печени снижена активность фермента аргиназы. К чему это может привести?
4. У ребенка одного года резко снижен уровень мочевины и повышен уровень аммиака. Как можно назвать такое состояние? Объясните возможный механизм изменений.
5. У больных сахарным диабетом развивается отрицательный азотистый баланс, а с мочой экскретируется повышенное количество мочевины. Почему?
6. При питании взрослого человека в основном белками растительного происхождения (вегетарианство) наблюдается отрицательный азотистый баланс. Почему?
ПРИЛОЖЕНИЕ
Среди множества веществ в организме особенно широко и разнообразно представлены белки. Нет других веществ с такими уникальными свойствами, позволяющими выполнять широкий спектр функций, причем таких, которые не могут быть выполнены никакими другими веществами организма человека. В этом смысле жизнь действительно зависит от тысяч различных белков. Вот почему белки являются незаменимой составной частью пищевого рациона и исключение их из пищи даже на короткий срок невозможно (для людей разного возраста). Это может привести к различным патологическим состояниям, быстро развивается белковая недостаточность (белковое голодание), последствием которой может быть –гипопротеинемия, снижение синтеза ферментов, гормонов и т.д. Недостаточность в белках в какой-то степени может наблюдаться у людей с особыми потребностями в питании (дети, беременные и кормящие матери, пожилые люди, перенесшие оперативные вмешательства, больные, выздоравливающие и т.д.).
При изучении белкового обмена важно знать, достаточно ли организм получает белков с пищей, а в связи с этим необходимо усвоить следующие понятия: норма белка в питании, пищевая ценность белка (соотношение заменимых и незаменимых аминокислот, содержание всех аминокислот), азотистый баланс (разница между поступлением азота в организм с пищей и выведение его с конечными продуктами обмена) и виды азотистого баланса (азотистое равновесие, положительный, отрицательный).
Источники белков для человека – пищевые продукты животного и растительного происхождения (молоко, рыба, мясо, яйцо, творог, соя, фасоль, горох и т.д.). Организм получает белки либо в нативном или в денатурированном виде, но проходить через клеточные мембраны они не могут, поэтому белки пищи никогда не поступают в состав тканей и органов без предварительного гидролиза (протеолиза) в желудочно-кишечном тракте.
Под действием протеолитических ферментов пищеварительных соков (желудочного, панкреатического, кишечного) белки расщепляются до свободных аминокислот (I этап обмена белков в организме)
Назначение этого процесса:
а) лишение белков видовой и тканевой специфичности;
б) обеспечение процесса всасывания, поступления в кровоток, затем в ткани;
в) возможность использования клетками организма в процессе метаболизма.
Поступившие в кровоток аминокислоты быстро поглощаются клетками печени, почек и др. и концентрация свободных АК в крови небольшая (~2,5 г во всем объеме крови), но и внутриклеточное содержание их также невелико. Принято считать, что в норме АК составляют так называемый сбалансированный внутриклеточный пул свободных аминокислот, который характеризует интенсивность процессов поступления и использования (расходования) аминокислот.
Все клетки, за исключением эритроцитов, используют АК прежде всего на анаболические процессы: для синтеза самых разнообразных белков и множества других веществ. И совсем незначительная часть АК подвергается процессам катаболизма (окисления). Последнее становится возможным лишь в 3 случаях:
1) если АК для синтетических процессов в данный момент клетками больше не используются;
2) если организм с пищей получает их больше, чем ему необходимо для белкового синтеза;
3) если организм оказался в особой ситуации дефицита основных энергетических субстратов (глюкозы, ТАГ), т.е. тогда, когда в качестве энергетического топлива вынужденно используются белки (сахарный диабет, голодание, раковые заболевания, состояние невесомости и др.).
Следует помнить, что аминокислоты не откладываются в запас и в организме нет какой-либо специальной формы хранения аминокислот, подобно гликогену или ТАГ.
Исходя из химического строения аминокислот процессы катаболизма можно условно разделить на следующие: а) по – NH2 группе (трансаминирование, дезаминирование, трансдезаминирование); б) по – СООН группе (декарбоксилирование); в) по углеводородному скелету.
Более подробно следует остановиться на процессе трансаминирования аминокислот (переаминировании), в котором всегда участвуют a-аминокислота (донор, поставщик NH2 групы) и a-кетокислота (акцептор -NH2 групы) особенно a-кетоглутаровая. В результате образуется новая аминокислота и соответствующая a-кетокислота. Процесс катализируют ферменты - аминотрансферазы, простетической группой которых является фосфорный эфир витамина В6 (фосфопиридоксаль). Особое внимание должно быть уделено двум ферментам - АлАТ и АсАТ, активность которых в норме достаточно высокая в различных тканях и, особенно, в печени и сердечной мышце, и низкая - в сыворотке крови. Их активность возрастает в крови при патологии печени (профзаболевания при отравлении различными ядами, циррозе, гепатите) – главным образом АлАТ и инфаркте миокарда – АсАТ, что очень важно для диагностики и оценки результатов лечения.
Исключительная роль в процессе трансаминирования принадлежит a-кетоглутаровой и глутаминовой кислотам.
Смысл трансаминирования в его коллекторной (собирательной) функции, т.е. в том, что -NН2 группы от разных аминокислот “собираются” в единственном соединении; в a- глутаминовой кислоте, т.к. акцептором -NН2-групп от большинства аминокислот является a-кетоглутарат.
Таким образом, катаболизм многих аминокислот приводит в конечном итоге к одному единственному метаболиту.
Существуют различные виды дезаминирования, в организме человека, главный путь – окислительное дезаминирование, которое может быть двух видов: прямое окислительное дезаминирование и непрямое (трансдездезаминирование).
Было установлено, что в митохондриях ткани печени, мозга, мышц находится НАД+ - зависимый фермент, который способен с большой скоростью дезаминировать одну единственную аминокислоту – глутаминовую - в условиях физиологического значения рН – 7,4. Это фермент – глутаматдегидрогеназа (ГДГ), с участием которого глутаминовая кислота подвергается прямому окислительному дезаминированию с образованием свободного аммиака, a-кетоглутарата, воды и 3 АТФ (с участием ЦТЭ I типа).
