Флуоресцентная спектроскопия

Флуоресцентные методы исследования являются более чувствительным, чем поглощающая спектроскопия. Термином флуоресценция обозначают испускание кванта видимого или УФ-света возбужденной молекулой, при переходе электрона с возбужденного синглетного уровня на основной уровень (S^* ® S₀). Возбужденное состояние молекулы при поглощении квантов электромагнитной волны, является неравновесным, и молекула быстро возвращается в основное состояние. Время нахождения электронов на возбужденных синглетных уровнях составляет 10^-8 – 10^-9 с. За это время электрон переходит на основной уровень, излучая энергию в виде тепла (инфракрасное излучение) или в виде квантов видимого или УФ-света (флуоресценция) (рис. 5).

При соударениях возбужденной молекулы с соседними молекулами возможна переориентация спина возбужденного электрона, и он переходит на триплетный Т^* уровень. Триплетное состояние электронов является более стабильным, чем синглетное. Время нахождения электронов на триплетном уровне может составить несколько часов. Переход электрона с возбужденного триплетного уровня на основной (Т^* ® S₀) также может сопровождаться испусканием квантов света. Это явление называется фосфоресценцией. Флуоресценция и фосфоресценция зависят от типа молекул и от их окружения. Интенсивность флуоресценции изменятся в зависимости от длины волны возбуждающего света.

Спектр флуоресценции – зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны испускаемого света. Спектр возбуждения – зависимость флуоресценции описывается квантовым выходом Q – отношением числа излученных квантов n_f к числу поглощенных квантов n_a:

Q = n_f /n_a

Интенсивность флуоресценции измеряют на приборах - спектрофлуориметрах.

Рис. 5. Схематичное изображение процессов флуоресценции и фосфоресценции (Костюк,81с)

S – синглетные уровни; Т- триплетные уровни; а –поглощение энергии (S₀ ® S₁^* переход); n- флуоресценция (S₁^*® S₀ переход); f- фосфоресценция (Т₁^*® S₀ переход); p – безизлучательный переход.

На рисунке 6 показана стандартная схема прибора для измерения флуоресценции. Во многом, устройство спектрофлуориметра сходно с устройством поглощающего спектрофотометра. Свет высокой интенсивности проходит через монохроматор, поглощается веществом в прозрачной кювете. Так как излучаемые флуоресцирующим веществом лучи испускаются во всех направлениях, то светочувствительный детектор установлен перпендикулярно направлению падающего луча. Это исключает измерение интенсивности проходящего через кювету падающего света. При флуоресцентном анализе макромолекул используются два типа флуоресцирующих хромофоров: флуоресцирующие группировки в составе самих молекул и внесенные флуоресцирующие хромофоры, связанные с компонентами макромолекул (флуоресцентная метка).

Рис. 6. Схема устройства спектрофлуориметра. (Фрайфельдер, 419 с)

1. источник света; 2 – монохраматор возбуждающего света; 3 – возбуждающий свет; 4 – кювета с образцом; 5 – прошедший свет; 6 – испускаемый свет; 7 – монохраматор испускаемого света; 8 – детектор света.

Собственная флуоресценция белков. В составе белковых молекул содержатся три флуоресцирующих хромофора – остатки тирозина, триптофана и фенилаланина. Наиболее интенсивной флуоресценцией характеризуются триптофан и тирозин. Например, в водном растворе спектр возбуждения триптофана лежит в области длин волн от 200 до 300 нм, спектр флуоресценции – от 300 до 440 нм с l_f^max = 353 нм (Рис.7). Квантовый выход Q = 0.13 и время жизни t = 3,1 нс.

Интенсивность флуоресценции и другие параметры (l_f^max, Q, t) остатков аминокислот и сильно зависят от микроокружения (от типа растворителя, рН –раствора, присутствия других молекул или соседних групп в составе полипептида). Поэтому измерение флуоресценции дает ценную информацию об конформации белковых молекул. Для интерпретации данных собственной флуоресценции белков пользуются эмпирическими правилами и закономерностями, полученных при изучении модельных соединений с хорошо известной структурой и конформацией.

Рис.7. Спектры поглощения (возбуждения) и флуоресценции триптофана в водном растворе (Фрайфельдер, 417 с.)

1– спектр поглощения; 2 - спектр флуоресценции.

Флуоресцентные метки и зонды. Для исследования методом флуоресценции в изучаемую молекулу связывают с флуоресцирующим хромофором. Такой способ исследования получил название «метод флуоресцентных меток (зондов)». Для исследования белковых молекул в качестве таких меток используют 1-анилин-8-нафталинсульфонат-анион, 1-ДИМЕТИЛАМИНОНАФТАЛИН-5-СУЛЬФОНАТ-АНИОН, РОДАМИН, флуоресцин. В качестве меток для нуклеиновых кислот используются акридиновый оранжевый, профлавин, акрифлавин, этидийбромид. Соединение, используемое в качестве флуоресцентной метки, должно удовлетворять следующим критериям: 1) хорошо должно связываться с определенным участком исследуемой молекулы; 2) его флуоресценция должна быть чувствительна к зменению условий окружения; 3) оно не должно оказывать влияние на свойства исследуемой макромолекулы.