Алгоритм приготовления мазка

и з культуры, выращенной на скошенном агаре(«косячке»)

1. Предметное стекло аккуратно берут за ребро и с обратной стороны нанесения мазка наносят его границы и номер культуры

2. Зажигают спиртовку, горелку, предварительно выпустив пары спирта

3. Фламбируют поверхность стекла, где будет располагаться мазок

4. Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри

5. В левую руку берут пробирку со стерильным физическим раствором (дистиллированной водой) и помещают между 1 и 2 пальцами таким образом, что ладонь находится под пробиркой и горлышко пробирки направлено в зону спиртовки

6. В правую берут бактериальную петлю, как карандаш

7. Петлю фламбируют до покраснения сначала горизонтально, затем вертикально (рис. №1)

8. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку физ.р-ра к ладони и осторожно вынимают е из пробирки. Движения должны быть плавными

9. Горло пробирки обжигают в пламени и вводят петлю

10. Берут выпускной петлей физ. р-р и выносят на стекло пару капель в границы мазка

11. Закрывают пробку, предварительно проведя через пламя спиртовки пробку и горло пробирки одновременно

12. Ставят пробирку в штатив

13. В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку с физ. р-ром (см. пункт №5), петля в правой руке

14. Петлю фламбируют

15. Над пламенем спиртовки спокойно вынимают пробку с культуры (см. пункт №8), одновременно обжигая пробку и горло пробирки

16. Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки

17. Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не повреждая агара, и вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки

18. Петлю с культурой вносят в каплю физ. р-ра и осторожно эмульгируют, незаходя за границы мазка

19. Бактериальную петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки

20. Прожигают горло пробирки пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку.

21. Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив

22. Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе либо высоко над пламенем спиртовки

Примечание:

1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, не требует использования физ. р-ра. Мазок готовят согласно пунктам №13 -№22

2. При приготовлении мазка из культуры, выросшей на чашке Петри необходимо:

· отметить изолированную колонию со стороны дна чашки

· чашку берут в левую руку и в сторону спиртовки приоткрывают крышку, придерживая ее 1и 2 пальцами левой руки

· прокаленную петлю вводят под крышку чашки, остужая ее о крышку

· осторожно откалывают часть выделенной колонии и, не задевая края чашки, выносят на стекло с физ. р-ром

· дальнейшие манипуляции согласно пунктам №18, 19, 21, 22

3. При подсушивании мазка следует помнить: высокая температура может нарушить структуру клетки

Рис. №1. Схема приготовления мазка

Виды фиксации

ü Физический – в пламени спиртовки

ü Химический – в растворах спирта, ацетона, смеси Никифорова (1:1 спирт и эфир)

Цели фиксации

ü Обеззараживание патогенных микробов

ü Закрепление клеток на стекле

ü Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители

СПОСОБ ГРАМА

1. На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1-2 мин

2. Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин

3. Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15-20 мин в зависимости от толщины мазка

4. Спирт смыть дистиллированной водой

5. Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2-3 мин

6. Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией

7. Микроскопия с иммерсией.

Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки (рис. №2). Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет

Грамположительные (Гр+) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Гр-) бактерии окрашиваются в красный цвет.

Рис. № 2. Грамотрицательные и грамположительные бактерии

Грамположительные микроорганизмы