Лекции.Орг


Поиск:




Визначення активності ферментів у неспряжених та спряжених ферментативних реакціях




Безперервні методи визначення активності ферментів

Безперервні методи дають змогу безперервно стежити за ходом реакції, починаючи від нульового часу до її завершення з майже миттевою реєстрацією даних [3]. Переважно вони грунтуються на різниці в поглинанні світла субстратом і продуктом або реакція супроводжується утворенням кислоти, виділенням тепла, утворенням флюоресціюючих сполук. Такі реакції звичайно є неспряженими і безперервними. Прикладом можуть бути реакції, каталізовані ферментами, наведеними в таблиці 1.

Таблиця 1

Визначення активності ферментів у неспряжених ферментативних реакціях

 

Назва ферменту Реакція, що каталізується Спостереження
ЛДГ L-лактат + NAD+ → піруват + NADH + H+ Утворення NADH (поглинає світло при 340 нм.)
ЛДГ піруват + NADH + H+ → L-лактат + NAD+ Зменшення NADH (поглинає світло при 340 нм)
Неспецифічні фосфатази р- нітрофенілфосфат → нітрофенол + фосфат Утворення нітрофенолу (поглинає світло при 405 нм)
Хімотрипсин р- нітрофеніловий ефір N-t-BOC-L-фенілаланіну → N-t-BOC-L-фенілаланін + р- нітрофенол Утворення нітрофенолу (поглинає світло при 405 нм)
Гексокіназа D- Глюкоза + Mg-ATP → глюкозо-6-фосфат + Mg-ADP + H+ Утворення кислоти, зміна рН

 

Визначення активності ферментів у неспряжених та спряжених ферментативних реакціях

Спряжені безперервні методи застосовуються у випадку, коли продукт реакції не можна виявити безпосередньо – він виділяється і піддається хімічному або ферментативному перетворенню в сполуку, кількість якої вимірюється. Реактанти, що додаються, повинні діяти за таких умов, що й фермент, активність якого визначається. Ці реактиви не повинні впливати на активність досліджуваного ферменту. Реакції, в яких досліджувану речовину попередньо підготовляють, називаються допоміжними, а реакції, що використовуються для фактичного визначення – індикаторними [2]. Прикладом спряжених хімічних реакцій може бути реакція визначення ацил-S-CoA.

 

Ацил-S-CoA + HX → Ацил-X + CoA-SH

- ця реакція підготовча, допоміжна.

Наступною може бути хімічна індикаторна реакція: з використанням 5,5'-дитіо-біс-2 нітробензойної кислоти (DTNBA); продукт реакції визначається при 412 нм [1].

Спряжені ферментативні реакції використовують найчастіше. Наприклад, необхідно виміряти активність тріозофосфатіозомерази, яка каталізує реакцію:

 

Гліцеральдегід-3-фосфат тріозофосфатізомераза дигідроксіацетонфосфат

 

Дигідроксіацетонфосфат, що утворився в попередній реакції, можна визначити за допомогою наступної реакції:

 

Дигідроксіацетонфосфат + NADH + H+ гліцерол-3-фосфат дегідрогеназа(NAD+) sn-гліцерол-3-фосфат + NAD+

У даному випадку індикаторний фермент- гліцерол-3-фосфат-дегідрогеназа (NAD+).

Іноді різні допоміжні реакції можуть мати одну і ту ж індикаторну реакцію, наприклад: [1]

 

Глюкоза + АТР гексокіназа ADP + Глюкозо-6-фосфат (допоміжна реакція).

Цю допоміжну реакцію можна використати і для визначення активності інших ферментів, внаслідок дії яких утворюється глюкоза.

Наприклад:

Мальтоза мальтаза глюкоза + глюкоза

ГК глюкозо-6-фосфат

Сахароза сахараза фруктоза + глюкоза

 
 


І спільною для всіх випадків може бути реакція з утворенням NADPH (індикаторна):

 

Глюкозо-6-фосфат + NADP+ глюкозо-6-фосфат-дегідрогеназа 6- фосфоглюконат + NADPH + H+ (індикаторна реакція)

 

 

Концентрації субстратів можуть бути визначені за допомогою кінетичних методів за умови, що швидкість ферментативної реакції являє собою лінійну фунуцію концентрації субстрату в односубстратних реакціях, коли Км менша від концентрації субстрату.

Треба зауважити, що різні комерційні препарати ферментів суттєво відрізняються за якістю і тому необхідно будувати калібрувальний графік для кожної серії експерементів, де використовують новий препарат. Результати виміру кількості субстратів у цьому випадку прямо пропорційні активності ферментів.

У тому випадку, коли субстрати присутні в малих кількостях, створюють системи регенерації. Метод дістав назву каталітичного дослідження, а субстрати служать проміжними каталізаторами, що регенеруються [4]. Найчастіше цей метод застосовується для визначення кількості кофакторів (NAD+, NADP+). Наприклад:

 

NAD+ + етанол алкогольдегідрогеназа ацетальдегід + NADН + Н+

 

Кількість утвореного NADН визначається завдяки використанню такої системи:

 

NADН + Н+ + Н+ + 2cyt c3+ цитохром-с-редуктаза 2cyt c2+ + NAD+

 

Загалом ця схема визначення NAD за методом каталітичного дослідження виглядатиме так:

 

Етанол АДГ ацетальдегід

 
 


NAD+ NADН + Н+

+ цитохром-с-редуктаза +

2cyt c2 2cyt c3+

 

 

Чутливість методу – 0,1 мкг (2 × 10 -10 моля х мл-1 NAD+). Дана система постійно регенерує NAD+. Вимір швидкості реакції проводять з урахуванням збільшення екстинції відновленого цитохрому с (cyt c2+)оглинає світло при 550 нм.

Для визначення малих кількостей кофакторів використовують також метод ферментативної циклізації [3]. За умов, коли неможливо провести спряження в одній системі регенеруючих та індикаторних ферментів, реакції проводять окремо. Для визначення NADP+ можна циклізувати глутаматдегідрогеназну та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну реакцію. Регенерацію ведуть 30 хв, реакцію зупиняють і визначають кількість 6-фосфоглюконату ферментативним методом:

глутаматдегідрогеназа

 
 


2 - оксоглутарат + NH3 глутамат + H2O

+ NADРН + Н+ +

6-фосфоглюконат NADР+

 

глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа

 

Регенерація 5 – 10 тис. молекул NADРН здійснюється за 30 хв. Кількість 6-фосфоглюконату визначають у фосфоглюконатдегідрогеназній реакції за методом кінцевої точки. Чутливість методу зростає до 10-8 - 10-10 моль х мл-1, або якщо використати флуоресцентний метод, то до 10 -13 моль х мл-1.

У деяких випадках виникає потребареєстрації NAD(Р)-залежних реакцій у видимій частині спектра, тобто провести візуалізацію цих реакцій [2]. Для цього дегідрогеназні реакції спряжують з відповідними окисно-відновними реакціями, в ході яких утворюються забарвлені продукти (метиленовий синій, гексаціаноферат ΙΙΙ, окис марганцю, хінони, цитохром с).

Частіше використовуються солі тетразолію, які переходять у процесі відновлення в інтенсивно забарвлені продукти, причому атмосферний кисень практично не впливає на реакцію. Похідні 1,2,3,4-тетразолію мають ароматичні замісники в положеннях 2,3,5 і четвертинний азот; у дитетразолієвих сполуках два тетразолієвих кільця з’єднані ароматичною групою.

Ці сполуки добре розчиняються у воді, а відновлені форми тетразолієвих солей (формазани) у воді нерозчинні, проте добре розчиняються в органічних розчинниках. Моноформазани – червоні, а диформазани – від блакитного до чорного кольорів. Реакція відновлення спонтанно майже не відбувається, каталізатором цього процесу може бути фермент діафораза (NADН: ліпоамід оксидоредуктаза).

NADН + Н+ + діафораза (FAD) → NAD+ + діафораза (FADН2)

діафораза (FADН2) + тетразолієва сіль → діафораза (FAD) + формазан

 

Як відновлювач, може бути використана інша сполука – феназинметосульфат (FMS, 5-метилфеназонійметосульфат) або блакитний 3R (8-диметиламіно-2,3-бензофеноксазин), який практично нечутливий до світла і має більшу швидкість переносу водню.

Ці реакції застосовують для візуалізації ферментів у гелях. Окремі метаболіти можуть бути визначені також з використанням хромогенів. При цьому як допоміжні ферменти застосовуються оксидази, внаслідок дії яких окислюється субстрат (глюкоза, етанол, метанол) і утворюються пероксид водню [2]. У присутності пероксиду водню і пероксидази хромогени утворюють забарвлені продукти, які реєструються спектрофотометрично. Хромогеном може бути одна сполука (гваякол, 2-аміносаліцилат, о-діанізидин, о-толуїдин) або суміш двох сполук, які під час окислення утворюють забарвлений продукт (4-аміноатрипірин + фенол, гваякол + N,N-діетил-р-фенілендіамін):

У випадку використання спряжених систем виникає чимало питань практичного змісту: 1) яку кількість взяти спряжувального ферменту, щоб він не лімітував реакцію; 2) чи доступний спряжувальний фермент у достатній кількості; 3)чи є домішки в спряжувальному ферменті; 4) як можуть інші ферменти, що містяться у досліджуваному зразку, спотворювати дані вимірів?

 





Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2015-11-05; Мы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 525 | Нарушение авторских прав


Поиск на сайте:

Лучшие изречения:

Студент всегда отчаянный романтик! Хоть может сдать на двойку романтизм. © Эдуард А. Асадов
==> читать все изречения...

997 - | 818 -


© 2015-2024 lektsii.org - Контакты - Последнее добавление

Ген: 0.009 с.