Офіційне визнання унії папою римським викликало бурхливий протест православної громади. Особливе невдоволення висловлював князь К. Острозький. Щоб урегулювати цей конфлікт, у жовтні 1596 року київський митрополит Михайло Рогоза та польський король Сигізмунд III Ваза скликали церковний собор у м. Бересті, під час якого між його учасниками відбувся розкол. Противники унії (К. Острозький, представник Константинопольського патріарха Никифор, львівський єпископ Г. Балабан та перемишльський єпископ М. Копистинський) організували з частиною духовенства та мирян окремий православний собор і засудили діяльність М. Рогози та прибічників унії. Митрополит М. Рогоза та вірні йому єпископи провели згідно з канонічним правом собор, у якому взяли участь, крім митрополита, 5 єпископів, частина духовенства та шляхти, а також представники католицької церкви. На цьому соборі був затверджений Берестейський акт.
За Берестейською унією українська церква зберігала:
• східні обряди;
• церковнослов'янську літургійну мову;
• право на заміщення митрополичої та єпископських кафедр;
• старий (юліанський) календар;
• право на одруження нижчого духовенства тощо;
А також визнавала:
• зверхність папи римського над усією християнською церквою;
• учення католицької церкви.
Православне духовенство, яке підтримало рішення Берестейського собору, одержало низку привілеїв:
• зрівняння в правах з католицьким духовенством;
• звільнення від сплати податків і виконання різноманітних повинностей;
• єпископам були обіцяні місця в сенаті Речі Посполитої (цієї обіцянки уряд не дотримав).
Шляхта й міщани, що прийняли унію, також зрівнювалися в правах з католиками латинського обряду й одержали право займати посади в державних та міських урядах. Одразу ж після Берестейського собору з восьми єпархій Київської митрополії унію прийняли шість: Київська, Володимиро-Берестейська, Турово-Пінська, Луцька, Холмська та Полоцька; Перемишльська та Львівська єпархії прийняли її згодом, відповідно 1692 року та 1700 року.
Так постала нова греко-католицька (уніатська) церква, яка підпорядковувалася Римові. У цієї церкви одразу з'явилося чимало прихильників та опонентів. У християнському світі України стався розкол: значна частина православних не прийняла унії, як і багато католиків не визнали греко-католицької церкви. Відомий український історик Н. Полонська-Василенко з цього приводу писала: «З самого початку виявилося, що польський уряд не бажає визнати за уніатськими єпископами прав римо-католицьких єпископів: вони не дістали місць у сенаті, незважаючи на листи в цій справі папи Климента VIII... Польські єпископи також не хотіли визнавати її [церкву. — Авт.], рахуючись не з релігійними поглядами, а з національністю уніатів. Православні ненавиділи уніатів за їх зраду..., а римо-католицька церква не вважала їх за повноцінних братів, бо вирішальною для неї була національна різниця між уніатськими українцями та католицькими поляками». Між противниками і прихильниками унії спалахнула гостра боротьба. Братства й українське козацтво, що зароджувалося, непохитно стали на захист православної віри.
