Требования, предъявляемые к питательным средам.

Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.

 

№19 Выделение чистых культур аэробов

Чистая культура — это популяция микроорганизмов одного вида. Для выде­ления чистой культуры аэробов используют методы, основанные на:

1. Механическим разобщением бактериальных клеток;

2. Действии физических и химических факторов, оказывающих избира­тельное действие;

3. Способности некоторых бактерий размножаться в организме.

Метод Дригальского основан на механическом разобщение на поверхности плотной питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуе­мого материала.

I этап.

1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).

2. Посев в чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового мате­риала, засевают вторую и третью чашки.

3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С.

II этап.

1. Микроскопическое изучение колонки по величине, форме, окраске, ха­рактеру поверхности, краев, консистенции колонии.

2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).

3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным ога-ром.

4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С. III этап.

 

№20 Выделение чистой культуры анаэробов

Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов Необходимым условием при культивировании анаэробов является защита их от токсического воздействия молекулярного кислорода. Это достигается при по­мощи физических, химических и биологических методов. Физические методы: 1. Регенерация сред. Для удаления растворенного в питательных средах кисло­рода производят их кипячение в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45-50°С. После посева культуры для предот­вращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином. 2. Посев в “высокий столбик агара”. Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С и вносят исследуемый материал. Пробирки с посевами помещают в обычный термостат. В высоком столбике плотной или полужидкой питательной среды кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине остаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов. 3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в механическом удалении воздуха из гер­метически закрытого сосуда, который называется анаэростат, при помощи ва­куумного насоса с последующей заменой его инертным газом или бескислородной газовой смесью. Химические методы: 1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде 2. Применение гидросульфита натрия для поглощения кислорода из замкнуто­го пространства. 3. Использование редуцирующих веществ. Для связывания остатков кислорода в питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин. 4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах). Для образования водорода и двуоки­си углерода используют специаль­ные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород генерируется таблетками боргидрида натрия. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. Биологический метод Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый ма­териал, а на другую – лабораторную культуру известных аэробных бактерий. После посева чашку гер­метично закрывают крышкой. Вначале вырастают аэробы, поглощающие кислород, а затем – анаэробы. Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов Для получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы: Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхно­сти плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдержива­ют в термостате при 37°С в течение 24-72 часов. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахар­ным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капил­ляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате. Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлаж­денным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно раз­мешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый ко­нец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревян­ных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6x6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри. Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является ме­тод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель меж­ду краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов. Выращивание чистой культуры анаэробов производят путем посева материала из изолированной колонии на среду Китта-Тароцци, в состав которой входит мясной бульон, глюкоза и кусочки печени или фарша. Для предотвращения доступа кислорода среда покрыта слоем вазелинового масла.

№21 Питательные среды для культивирования микробов

O сновные требования к питательным средам:

1. прозрачность,

2. стерильность

3. лёгкая усвояемость

4. определенный состав азотистых веществ, углеводов, витаминов,

5. изотоничность,

6. определённая вязкость и окислительно-восстановительный баланс

Основные питательные среды. Многочисленные потребности микроорганизмов предопределяют большое разнообразие питательных сред, а для отдельных видов бактерий существуют специальные среды. Часть их готовят в лабораториях непосредственно перед посевом, но с каждым годом появляются все новые и новые среды заводского изготовления (сухие), которые способны удовлетворить самые прихотливые потребности микробиологов. Они сохраняются длительное время, имеют стандартный состав.

Среды разделяются на естественные и искусственные. Как естественные используют свернутую сыворотку, молоко, яйца, мышечную ткань. Искусственные среды создают путем комбинирования разнообразных субстратов, которые обеспечивают те или другие потребности микроорганизмов. Их используют в основном для экспериментального изучения отдельных звеньев метаболизма бактерий.

В зависимости от своей плотности, среды разделяются на жидкие, полужидкие и плотные. Полужидкие и плотные среды готовятся из жидких, добавляя соответственно 0,3-0,7 % но 1,5-2,0 % агара. Последний представляет собой волокнистый материал, который добывают из морских водорослей. Состоит он из полисахаридов (70-75 %), белков (2-3 %), основными составляющими частями является высокомолекулярные агароза и агаропептин. Агар растворяется в воде при повышенной температуре, а, застигая, предоставляет среде драглеподібної консистенции и стойкости к ферментным системам бактерий. Именно за эти свойства он приобрел широкое распространение в микробиологической практике. Для создания плотных сред используют также желатин (10-15 %), свернутую сыворотку крови.