Правила работы и техника безопасности в микробиологической лаборатории

Лабораторная работа № 1

Структура и материально-техническое обеспечение лаборатории микробиологии. Лабораторное оборудование, применяемое в микробиологических исследованиях

 

Цель работы. Ознакомление с основными подразделениями и размещением лаборатории микробиологии.

Материалы и оборудование: пробирки бактериологические, шпатели Дригальского, пастеровские пипетки, ватно-марлевые пробки, штативы для пробирок, чашки Петри, колбы на 500 и 1000 мл, мерные цилиндры на 100 мл, пипетки градуированные на 1 и 10 мл, ручные дозаторы, воронки, фильтровальная бумага, вата, марлевые салфетки, индикаторная бумага для определения pH, дистиллированная вода, сухие готовые питательные среды, химические реактивы, красители, горелки газовые или электроплитки, водяные бани, весы электронные, термостат, автоклав, центрифуга, pH-метр, дистиллятор, настольная лупа.

Задание:

1. Ознакомиться с основными подразделениями и размещением лаборатории микробиологии.

2. Изучить лабораторное оборудование, основные принципы работы приборов.

 

Теоретическая часть

Различают микробиологические лаборатории нескольких типов: учебные, производственные и научно-исследовательские. Организация работы в лабораториях разных типов определяется стоящими перед ними задачами. Учебные лаборатории призваны знакомить будущих специалистов – микробиологов с основными методами диагностики, профилактики и терапии инфекционных болезней рыб.

Лаборатория микробиологии включает группы, занимающиеся изучением инфекционных болезней рыб. При проведении исследований большое значение имеет материально-техническое оснащение лаборатории. Кроме того, серьезные требования предъявляются к ее размещению.

Лаборатория микробиологии состоит из нескольких помещений, различающихся по целевому назначению, оборудованию и режиму работы. При этом особое значение имеет устройство подразделения лаборатории, в котором осуществляются бактериологические и микологические исследования. В составе лаборатории микробиологии выделяют следующие помещения.

1. Комната кабинетного типа, где проводят анализ данных эпизоотологического исследования, обработку результатов лабораторных работ и при необходимости – некоторые лабораторные исследования, например, микроскопию фиксированных препаратов.

2. Комната для лабораторных работ. Здесь исследуют рыбу (осмотр, вскрытие, взятие патологического материала), изучают патологический материал и выделенных возбудителей.

3. Препараторская. В этой комнате размещают основное оборудование лаборатории. Здесь же находятся реактивы, необходимые в работе лаборатории.

4. Аквариальная служит для проведения исследований, связанных с выяснением патогенной значимости выделенных возбудителей (постановка биологической пробы) и подбором эффективных профилактических и лечебных средств.

Микробиологический отдел лаборатории включает ряд помещений, где проводят работу с микроорганизмами. Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет стерилизационную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы, бокс, моечную, комнату для приготовления питательных сред и реактивов.

Для проведения стерильных работ при изучении возбудителей инфекционных болезней рыб бокс может быть оборудован в комнате для лабораторных работ. Воздух и поверхность предметов в боксе должны быть стерильны. С этой целью помещение бокса герметизируют, а бокс оборудуют бактерицидными лампами. Бокс служит для работы с культурами микроорганизмов и представляет собой небольшую изолированную комнату, разделенную перегородкой на две части (собственно бокс и предбоксник). Оборудование бокса состоит из стола, стула, газовой горелки (или спиртовки) и бактерицидной лампы настенного или настольного типа. Удобно иметь в боксе приставной столик, на котором размещают необходимые во время работы предметы.

Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки. Рабочий стол до и после окончания работы дезинфицируют 70 %-ным раствором этилового спирта или растворами хлорсодержащих препаратов (хлорамина Б и других).

Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения (в течение 30-60 мин) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом помещения. Более эффективный и надежный способ дезинфекции воздуха – облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 200 до 400 нм. Эти лучи обладают высокой антимикробной активностью и могут вызвать гибель не только вегетативных форм микроорганизмов, но и спор.

В бокс входят через предбоксник, где надевают чистый халат. Там же размещают шкаф для хранения стерильной посуды.

При отсутствии отдельного помещения для бокса используют ламинарные шкафы или боксы настольные (рисунок 1).

 

                              а)                                                   б)

 

Рисунок 1 – Оборудование для проведения стерильных работ в лаборатории

(а – ламинарный шкаф, б – настольный бокс)

 

Бокс может быть изолированным от общего помещения (рисунок 2)

 

Рисунок 2 – Изолированный бокс

Правила работы и техника безопасности в микробиологической лаборатории

Правила работы и техника безопасности при обращении с культурами микроорганизмов и гельминтами регламентируются СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами» (Минздрав России, Москва, 1999).

Каждый сотрудник лаборатории должен иметь закрепленное за ним рабочее место. Каждое рабочее место имеет обязательный комплект оборудования: спиртовую или газовую горелку; закрывающиеся контейнеры с дезинфицирующим раствором; банку с дезинфицирующим раствором для использованных предметных и покровных стекол; плотно закрывающуюся банку для хранения чистых, обезжиренных стекол в смеси Никифорова; набор бактериологических петель разного диаметра; лупу 5-кратного увеличения; бинокуляр и микроскоп.

В ящиках стола находится дневной запас стерильных пастеровских и градуированных пипеток разного объема, резиновая груша или пипеточные дозаторы.

Перед началом работы следует надеть халат, который хранится отдельно от верхней одежды.

При работе со спиртовкой необходимо иметь под рукой одеяло или плотную ткань для быстрого тушения огня в случае аварии.

Насасывание в пипетки растворов химических реактивов и жидкостей, содержащих возбудителей инфекционных заболеваний рыбы, производят с помощью резиновой груши или автоматических дозаторов. Насасывание ртом не допускается.

Материал для исследования доставляют в лабораторию в контейнерах, биксах или сумках-холодильниках. Ёмкости с жидкими материалами закрывают пробками, исключающими выливание содержимого во время транспортирования. Дно контейнеров, содержащих емкости с патологическим материалом, покрывают адсорбирующим материалом (марлевая салфетка, ткань и др.). Не допускается доставка материала в хозяйственных сумках, чемоданах и других предметах личного пользования. Сопроводительную документацию к направляемому материалу прилагают отдельно, в полиэтиленовом пакете.

Для посевов используют бактериологическую петлю, замкнутую в непрерывное кольцо, с плечом не более 6 см. Допускается применение одноразовых промышленно изготовленных петель с большей длиной плеча.

Работа с первичными посевами исследуемого материала и чистыми культурами микроорганизмов проводится вблизи пламени горелки. В процессе работы каждая процедура по взятию или внесению в среду культур микробов или пересеваемого материала сопровождается фламбированием (обжиганием) «горлышка» сосудов (колб, пробирок, флаконов), из которых берут или в которые вносят исследуемый материал. Соответственно перед проведением каждого посева и после него бактериологические петли и стеклянные шпатели прокаливают в пламени горелки.

ЗАПРЕЩАЕТСЯ прикасаться руками к исследуемому материалу и культурам микробов. Все необходимые операции с названными объектами проводятся только с использованием специальных инструментов. Запрещается переливать жидкости, содержащие живые клетки микроорганизмов, из одного сосуда в другой; оставлять на столах нефиксированные мазки, открытую посуду с посевами.

 

По окончании работы все посевы убирают в термостаты и обязательно проводят дезинфекцию рабочих поверхностей столов.

Использованные в работе с инфицированным материалом стеклянные шпатели, пастеровские и градуированные пипетки погружают в емкость с дезинфицирующим раствором. Отработанный заразный материал помещают в специальные закрывающиеся контейнеры и сдают для дальнейшего обеззараживания в автоклавах.

Каждый сотрудник лаборатории должен быть обеспечен индивидуальной рабочей одеждой: медицинскими халатами, сменной обувью, одноразовыми перчатками в соответствии с действующими правилами. До проведения исследований в предбокснике рабочий халат снимают и для работы в боксе надевают новый халат.

Смена рабочей одежды проводится по мере загрязнения, но не реже одного раза в неделю. Перед сдачей в стирку защитную одежду обеззараживают.

В лаборатории необходимо хранить как минимум недельный запас дезинфицирующих средств. Вновь поступающие на склад серии дезинфицирующих средств, следует контролировать на содержание действующего вещества. На емкости с дезинфицирующим раствором должны быть указаны его название, концентрация и дата приготовления.

Автоклавирование проводится персоналом, имеющим свидетельство об окончании специальных курсов.

Текущая уборка помещений проводится ежедневно влажным способом после окончания рабочего дня: в «чистой» зоне лаборатории – с применением моющих средств, в «заразной» зоне – с применением дезинфектантов. «Чистая» и «заразная» зоны лаборатории обеспечиваются отдельным промаркированным уборочным инвентарем, перенос которого из зоны в зону не допускается. В боксовых помещениях должна проводиться еженедельная генеральная уборка с применением дезинфицирующих средств путем протирания поверхности мебели, приборов, а также стен (на высоту до 2 м).

По окончании дезинфекционной обработки и влажной уборки в боксе включают бактерицидные УФ-лампы на 30-60 мин. В последнее время широкое распространение получили установки обеззараживания воздуха, которые могут работать в присутствии людей. Настенные закрытые установки «Аэробакт-10» и «Аэробакт-12», используемые в помещении лаборатории и боксов, изготовлены из кварцевого стекла высокой степени чистоты. Специальное покрытие исключает образование озона и вредных диоксидов в воздухе, обеспечивая УФ – излучение большой мощности, достаточное для разрушения всех микроорганизмов в помещении объемом 60 м³.

При возникновении аварийных ситуаций, таких как розлив инфицированного материала, в случае разбивания пробирок и чашек Петри с посевами, а также стеклотары в связи с перепадом температур при работе на автоклаве немедленно прекращают работу с культурами микроорганизмов и ставят в известность руководителя лаборатории. Все открытые части тела обрабатывают дезинфицирующим раствором или 70 % раствором этанола. При попадании инфицированного материала на слизистые оболочки их немедленно обрабатывают: глаза – 1 % раствором борной кислоты, несколькими каплями 1 % раствора азотнокислого серебра или струей воды; в нос закапывают, а рот и горло прополаскивают 0,05 % раствором перманганата калия или 1 % раствором борной кислоты. При аварии, приведшей к повреждениям кожных покровов, перчатки (если работа проводилась в них) обрабатывают дезинфицирующим раствором, снимают их, из ранки выдавливают кровь, руки обрабатывают 70 % раствором этанола, протирают их тампоном не менее 2 мин, затем моют водой с мылом, ранку смазывают раствором йода.

После обеззараживания места аварии защитную одежду замачивают в дезинфицирующем растворе.

Для ликвидации последствий аварии, а также профилактики возможного поражения сотрудников в лаборатории необходимо иметь аптечку для оказания экстренной медицинской помощи, запас дезинфицирующих средств, средства индивидуальной защиты (СИЗ), емкости для замачивания СИЗ, которые хранят в специально отведенном месте.

Аптечка экстренной помощи должна включать 70 % этиловый спирт, раствор йода, сухие навески перманганата калия, нитрата серебра и борной кислоты, которые в случае аварии растворяют в мерном объеме дистиллированной воды для получения требуемых концентраций дезинфицирующих средств, стерильную дистиллированную воду, глазные пипетки, ножницы, перевязочные средства, бактерицидный пластырь.

Лабораторное оборудование

Оборудование, применяемые в лаборатории микробиологии, делят на группы общего и специального назначения. Специальное оборудование применяют при определённых методах исследования: бактериологических, вирусологических, микологических, токсикологических. Оборудование общего назначения используют при разных методах исследования; оно включает микроскопическую технику, устройства для поддержания температуры, аппаратуру для очистки воды, стерилизаторы, центрифуги, pH-метры, приборы для взвешивания.

Термостат

Для выращивания бактерий и грибов, культивирования вирусов, изучения иммунитета и гистологических исследований необходимо выдерживать материал при постоянной температуре. Приборы, которые автоматически поддерживают определенную температуру воздушной или водной среды в рабочей камере, называют термостатами (рисунок 3). 

 

Рисунок 3 – Лабораторный суховоздушный термостат

 

Стенки прибора для улучшения теплоизолирующих свойств делают двухслойными. Между стенками находятся воздух или вода.

Для сушки и стерилизации лабораторной посуды применяют сушильные шкафы. Сушильный шкаф принципиально устроен так же, как термостаты на 25-60 °С, но приспособлен для создания более высоких температур (200 °С).

Водяные бани и термостаты служат для поддержания определенной температуры водной среды. Во внутренней камере этих приборов находится жидкость, в которую помещают штатив с пробами. Регулировка температуры воды от 30 до 100 °С осуществляется автоматически с помощью контактного термометра, соединенного с электронагревателями. На верхней крышке погружного термостата смонтирован двигатель, приводящий в движение мешалку и насос для перекачки подогретой воды в другие емкости. Поддержание стабильной температуры в открытых емкостях от 25 до 85 °С может быть осуществлено также с помощью погружного термостатирующего устройства УТП-1. Устройство состоит из двух разобщенных блоков: блока нагрева и перемешивания и блока управления.

При отсутствии автоматических нагревающих приборов используют электроплитку, на которую устанавливают металлическую емкость с водой. Пробирки с пробами и пробирку с термометром помещают в металлическую сетку или штатив и погружают в воду. Затем температуру в бане доводят до необходимой величины, следя за показаниями термометра. Температуру поддерживают на определенном уровне, включая или отключая плитку.

Для создания температуры 4-6 °С используют бытовые холодильники. Длительное замораживание материала осуществляют в морозильных камерах бытовых холодильников или в специальных морозильниках, обеспечивающих температуру до -25 °С.

Дистиллятор

Для приготовления питательных сред и растворов реактивов необходимо пользоваться очищенной водой. Одним из распространенных методов очистки, воды является перегонка (дистилляция), которая осуществляется с помощью дистилляторов (рисунок 4).

 

 

Рисунок 4 – Дистиллятор лабораторный ДЛ-25

 

В камере испарения воду нагревают до кипения. Образовавшийся пар поступает в конденсатор, который охлаждается водопроводной водой, непрерывно протекающей между стенкой конденсатора и наружным стальным кожухом прибора. Сконденсированный пар в виде дистиллята вытекает через ниппель. В верхней части испарительной камеры находятся отражательные, экраны, сепарирующие пар и обеспечивающие чистоту дистиллята. По мере выкипания воды в камере через вентиль поступают новые порции водопроводной воды, уровень которой поддерживается уравнителем.

При вирусологических и других исследованиях требуется вода с определенными физико-химическими свойствами. В таких случаях применяют повторную дистилляцию или пропускают воду через ионообменники. Для двукратной перегонки воды используют бидистилляторы БД-2 и БД-4.

Автоклав

При проведении микробиологических исследований необходимо приготовить стерильные питательные среды, растворы реактивов, посуду и т.д. Широко распространенным методом стерилизации является автоклавирование. Стерилизация в автоклаве осуществляется с помощью нагретого пара под давлением (рисунок 5).

 

Рисунок 5 – Стерилизатор паровой (автоклав) ГК-100-3

 

Стерилизатор может быть настольный (рисунок 6).

 

 

Рисунок 6 – Настольный стерилизатор (автоклав) TNP-88 М

 

Материал в металлических биксах или сетках загружают в стерилизационную камеру, которая сообщается с водопаровой камерой. Обе камеры герметически изолированы от атмосферного воздуха при помощи крышки. В водопаровую камеру заливают дистиллированную воду и после герметизации автоклава нагревают ее с помощью электронагревательных элементов. По достижении необходимого давления пара им заполняют стерилизационную камеру, вытесняя из нее воздух. По окончании продувки вентиль закрывают, и давление повышают до требуемой величины, определяемой по манометру. По окончании стерилизации перекрывают сообщение междуводопаровой и стерилизационными камерами, выпускают пар и конденсат и специальным приемом подсушивают материал под вакуумом. Затем давление в камере уравнивают с атмосферным и автоклав разгружают.

Шприцы и инструменты стерилизуют кипячением в электрических стерилизаторах, которые представляют собой оборудованные электрическим подогревом металлические ванны с крышкой.

Бактерицидный облучатель.

Для стерилизации воздуха и поверхности предметов в помещениях лаборатории применяют стационарные и переносные облучатели (рисунок 7).

 

 

                              а)                                       б)

 

Рисунок 7 – Бактерицидные облучатели (а – стационарный, б – переносной)

 

Стерилизацию (необратимые изменения микробных клеток, а затем их гибель) осуществляют с помощью ультрафиолетовых лучей (УФЛ), излучаемых бактерицидной лампой, укрепленной в штативе и соединенной с электропитающим устройством. Стационарный бактерицидный облучатель устанавливается на потолке или стене. Передвижной облучатель позволяет устанавливать необходимое расстояние от лампы до объекта, так как лампа с рефлектором подвижно закреплена на вертикальной стойке.

Центрифуга

Для разделения частиц и отделения их от растворителя при обработке патологического материала и культур возбудителей применяют центрифугирование (рисунок 8).

 

Рисунок 8 – Центрифуга лабораторная настольная ЦЛМН-Р 10-01

 

Принцип работы центрифуги заключается в том, что при вращении пробирок с материалом возникает центробежная сила, отбрасывающая частицы с большей плотностью, чем жидкость, на дно пробирки. Существует большое количество типов и моделей центрифуг. В микробиологии используют центрифуги с нерегулируемым температурным режимом, рефрижераторные центрифуги и ультрацентрифуги.

Все приборы имеют ряд общих элементов: вращающееся приспособление с гнездами для проб (ротор), электродвигатель, регулятор скорости вращения ротора и кожух с крышкой.

Кроме всего прочего в микробиологической лаборатории используют торсионные весы для взвешивания сухих сред и химических веществ, используемых для исследования, а также используют магнитные мешалки для приготовления растворов и рН-метр для определения активной реакции среды получаемых растворов (рисунок 9).

 

Рисунок 9 – Торсионные весы (слева); магнитная мешалка (справа): рН-метр (на переднем плане)

 

Для просмотра колоний бактерий, выросших на питательной среде в чашках Петри, используют специальную настольную лупу с подсветкой (рисунок 10).

 

Рисунок 10 – Настольная лупа