Тема: Микробиологическая диагностика менингококковых инфекций

Цель занятия:

1. Знать правила взятия и транспортировки в лабораторию исследуемого материала.

2. Знать схемы микробиологического исследования и уметь использовать микробиологические методы для диагностики менингококковой инфекции.

3. Изучить диагностические, профилактические и лечебные препараты.

Ход работы:

Задание 1. Правила взятия и транспортировки в лабораторию исследуемого материала.

1. Для бактериологического анализа обычно используют спинномозговую жидкость, взятую при люмбальной пункции или при пункции боковых желудочков мозга. Взятие спинномозговой жидкости проводят как можно раньше, желательно до начала антибактериального лечения. Проба отбирается со строгим соблюдением правил асептики. Спинномозговую жидкость доставляют в лабораторию в изотермических сосудах и немедленно исследуют: 1) анализируют количественными цитологическим и биохимическим методами; 2) проводят микробиологические исследования микроскопическим, бактериологическим и серологическим методами.

2. Исследуемый материал из носоглотки берут изогнутыми проволочными тампонами. Носоглоточную слизь берут с задней стенки носоглотки с помощью стерильного ватного тампона, намотанного на изогнутый под углом 45° конец проволоки, вводя тампон за мягкое небо. При исследовании слизи применяют только бактериологический метод.

3. От трупа исследуемый материал (гной с мозговых оболочек, из кожных поражений и др.) изучают только микроскопическим методом.

 

Задание 2. Знать схемы микробиологического исследования и уметь использовать микробиологические методы для диагностики менингококковой инфекции.

1. Морфология Neisseria meningitidis. Микроскопия исследуемого материала.

Для приготовления мазка из спинномозговой жидкости ее центрифугируют 5 минут при 3500 об/мин и из осадка делают мазки. Если присланная жидкость мутная, мазки готовят без центрифугирования. Промикроскопируйте и зарисуйте предложенный материал:

 

Окрашенный препарат Электронная микроскопия

Возможные варианты окрашенных препаратов:

l) N. meningitidis в чистой культуре, окраска по Граму и метиленовой синькой; 2) N. meningitidis в спинномозговой жидкости, окраска метиленовой синькой; 3) РИФ - люминесцентная микроскопия мазков N. memngitidis в спинномозговой жидкости при обработке флуоресцирующей противоменингококковой сывороткой.

Обнаружение грамотрицательных диплококков бобовидной формы, обращенных вогнутой стороной друг к другу и находящихся в лейкоцитах, свидетельствует о менингококковой этиологии менингита.

2. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции проводится с использованием микроскопического, бактериологического и серологического методов (схема № 1).

В предложенной схеме представлены основные этапы этих исследований.

Схема № 1. Микробиологическое исследование при менингококковой инфекции

Сыворотка крови

Кровь, Ликвор

Ликвор, кровь, гной, экссудат, носоглоточная слизь

Исследуемый материал:

Обнаружение антигена (экспресс диагностика)

Обнаружение антител:

1. Реакция встречного иммуно- электрофореза 2. Реакция латекс-агглютинации 3. Реакция иммунофлуо- ресценции 4. Радиоиммунный анализ 5. РНГА 6. Реакция коагглютинации 7. ИФА

РНГА с менинго- Кокковыми эритроци- тарными диагности- кумами серогрупп А, В, С

Выделение чистой культуры

Идентификация чистой культуры по свойствам: 1. Изучение морфологии 2. Посев на "пестрый ряд" 3. Определение антигенной структуры – р. агглютинации, р. микропреципитации в геле, иммуно- ферментный анализ (ИФА) 4. Серотипирование культуры 5. Определение чувствительности к антибиотикам

 

3. Исследовать ликвор больного с целью обнаружения менингококкового антигена с помощью реакции латекс-агглютинация для обнаружения специфических полисахаридных антигенов N. meningitidis A, B, C, Y/W в СМЖ. Для постановки реакции латекс-агглютинации СМЖ подогревают в течение 3 мин при 100°С и центрифугируют в течение 5 мин. По капле надосадочной жидкости и реагента, содержащего латексные частицы с моноклональными антителами к менингококкам, наносят на стекло и смешивают с помощью специальной палочки. Параллельно ставят реакцию с заведомо положительным контролем и реакцию с исследуемой СМЖ и латексными частицами с IgG не иммунизированного кролика.

Учет результатов осуществляется спустя 10 мин по феномену агглютинации, видимому невооруженным глазом. Положительная реакция - четкая агглютинация, в случае наличия агглютинации с заведомо положительным контролем и отсутствие реакции агглютинации с латексом с IgG не иммунизированного кролика, свидетельствует о наличии специфических антигенов N. meningitidis в СМЖ и указывает на его этиологическую роль в развитии менингита. Реакция не интепретируется, если агглютинация прошла с латексом для негативного контроля. В этом случае нужно повторить тест с другой порцией СМЖ.

 

Результат. Получена четкая агглютинация исследуемого материала (1), при достоверных контролях - агглютинации с заведомо положительным контролем (2) и отсутствие реакции агглютинации с латексом с IgG не иммунизированного кролика (3).

Опыт Контроль (+) Контроль (-)

Вывод:

Задание 3. Изучить препараты, используемые для специфической профилактики, терапии и диагностики менингококковой инфекции.

1.Вакцины менингококковые полисахаридные серогрупп А, С, А+С, A+C+Y+W135 применяются с профилактической целью в период эпидемического неблагополучия при показателе заболеваемости более 2,0 на 100 000 населения и с целью экстренной профилактики в очагах инфекции в первые 5 дней после выявления первого случая заболевания генерализованной формой менингококковой инфекции.

ФГУП «НПО «Микроген», Россия / «Санофи Пастер», Франция / «ГласкоСмитКляйн», Англия

2. Иммуноглобулин нормальный человеческий применяется для пассивной профилактики и лечения детей до 1 года.

3.Агтлютинирующие группоспецифические менингококковые сыворотки серогрупп: анти - A, B, C, Д, X, Y, Z, W135 и 29Е и др. используют для определения серогруппы выделенной чистой культуры.

4.Преципитирующие антименингококковые сыворотки серогрупп A, B, C, Д, X, Y, Z, W135 и 29Е применяют с целью обнаружения менингококкового антигена в спинномозговой жидкости методом встречного иммуноэлектрофореза.

5. Сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические преципитирующие, агглютинирующие серогрупп: A, B, C, Д, X,Y, Z, W135 и 29Е.

6. Менингококковые эритроцитарные диагностикумы серогрупп А, В и С применяются для выявления антител при менингококковой инфекции в реакции непрямой гемагглютинации.

Список литературы:

1. Зубков М.Н. Сбор, транспортировка биологического материала и трактовка результатов микробиологических исследований // Лабораторная диагностика. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2004,Том 6, №2, стр. 143-153.

2. Приказ Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. По состоянию на ноябрь 2007 года.

3. Е.Г. Волина, А.П. Аллилуев, Л.Е. Саруханова Методические указания к проведению микробиологической диагностики менингококковой инфекции // М: Издательство Российского университета дружбы народов. 2001г. 12с.