Тема №4. Специальные методы окраски и определение подвижности бактерий.

Цель занятия: изучить специальные методы окрашивания, технику окрашивания и учет результатов.

Материалы и оборудование: предметные стекла, реактивы, спиртовки, красители, сифон с дистиллированной водой, фильтровальная бумага.

Окраска кислото- и щелочеустойчивых бактерий.

В состав этих бактерий входит значительное количество жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40 %), поэтому они трудно воспринимают краски. Но если они окрасились при воздействии протравителя, то трудно уже обесцвечиваются кислотами, спиртами и щелочами.

Наиболее распространенным методом окраски бактерий данной группы является метод Циля—Нильсена. На фиксированный препарат кладут кусок белой фильтровальной бумаги (для предохранения от осадка), на него наливают раствор карболового фуксина, снизу препарат подогревают над пламенем до появления паров и оставляют на «мостике» (5...7 мин). Затем краску с бумажкой сливают (не промывая) и обесцвечивают 3...5%-м раствором серной кислоты (5...7 с), хорошо промывают водой и дополнительно окрашивают метиленовой синью Леффлера (4...5 мин). Далее препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Кислотоустойчивые (спирто-щелочеустойчивые) бактерии окрашиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), а некислотоустойчивые — в синий, т.к. легко окрасившись фуксином, они легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают вторичную окраску синью.

Методы окраски непостоянных элементов микробной клетки. В структуре микробной клетки различают постоянные и непостоянные элементы. Постоянные — это цитоплазма, оболочка, ядерное вещество; непостоянные — спора, капсула, жгутики, которые при определенных условиях формируются лишь у бактерий отдельных видов, поэтому служат видовым признаком.

Окрашивание спор.

Метод Ауески. Высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, протравливают 0,5%-и соляной кислотой с подогреванием (2...3 мин), охлаждают, промывают водой и фиксируют над пламенем. Затем на препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают на него карболовый фуксин Циля, окрашивают с подогреванием до паров (7...8 мин), краску сливают, препарат обрабатывают 5%м раствором серной кислоты (5-7 сек), хорошо промывают водой. Дополнительно окрашивают метиленовой синью (4-5 мин), опять промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют под иммерсией: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Меллера. Фиксированный на пламени препарат протравливают 5%-й хромовой кислотой (2-3 мин), промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой. Затем на препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают карболовый фуксин Циля, окрашивают с подогреванием до паров (7-8 мин), краску сливают, препарат обрабатывают 5%м раствором серной кислоты (5-7 сек), хорошо промывают водой. Дополнительно окрашивают метиленовой синью (4...5 мин), опять промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. Результат окраски тот же: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Златогорова. Процесс окраски, как в предыдущих двух методах, только без протравы. После окрашивания вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Пешкова. Мазок фиксируют, красят метиленовой синью с подогреванием до кипения, смывают. Докрашивают 1%-м водным р-ром нейтральрота (10 с), смывают, просушивают. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в красный.

Капсульное вещество плохо окрашивается, поэтому для его выявления применяют специальные методы окраски, основанные на явлении метахромазии.

Метод Михина. Фиксированный мазок из крови или препарат-отпечаток из ткани органа (печени, селезенки, почки) окрашивают метиленовой синью с подогреванием до появления паров (5-7 мин). Краску сливают, быстро промывают водой (можно не промывать), просушивают фильтровальной бумагой. Микробная клетка окрашивается в синий цвет, капсула — в светло-розовый.

Метод Романовского—Гимза. Фиксированный препарат окрашивают, как было указано выше: мазок-препарат помещают в чашку Петри на стеклянные или деревянные палочки отпечатком вниз, под препарат подливают краску, окрашивают 40...50 мин. Результат тот же, что и при окраске по Михину: микробная клетка окрашивается в синий цвет, капсула — в светло-розовый.

Метод Ольта. Свежий водный 2%-й р-р сафранина наливают на препарат и выдерживают 5-7 мин. Затем слегка промывают водой и высушивают. Вегетативная клетка – кирпично-красного цвета, капсула – желто-оранжевого.

Метод Бури-Гинса. Выявляют негативным контрастированием фона по Бури: черная тушь смешивается с культурой и высушивают → фиксируют на пламени → фуксин 1мин → промыв. На темном фоне видна бесцветная капсула и красные микробные тела

Определение подвижности бактерий.

Метод висячая капля. Капля молодой (≈ до 20 ч) бульонной культуры или каплю конденсата агаровой культуры бактериальной петлей наносят на покровное стекло, накрывают специальным предметным стеклом с углублением (края луночки смазывают вазелином), затем препарат переворачивают (покровным стеклом кверху), капля висит над лункой. Микроскопируют в затемненном поле.

Метод раздавленная капля. Каплю бактериальной взвеси помещают на предметное стекло, накрывают покровным так, чтобы не было пузырьков. Микроскопируют.

Метод Шукевича. Каплю взвеси вносят в конденсат скошенной плотной среды в пробирке. Подвижные бактерии, передвигаясь из конденсата растут на поверхности среды; неподвижные – размножаются в конденсате.